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猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2020年37卷第2期
人们对转录组学前期的研究主要集中在mRNA 表达上，进而分析基因在生物机体中调控作用。20世纪50年代发现了非编码RNA 中的重要RNA ，如rRNA ，tRNA 。在随后的30年，具有调节功能的非编码RNA 在细菌中首先被发现，而后才在大多数的真核生物中被发现[1]。后来发现很多物种的基因组在转录过程中也有许多非编码RNA （ncRNA ），但其功能仍存争议。但是伴随越来越多的ncRNA 被鉴定，并被证明其在机体发育和病理等过程中发挥了作用[2]，是真核细胞中新的调控层。H19作为第一个转录组中LncRNA 在猪上的研究进展 龚 龑，马海明
（湖南农业大学动物科学技术学院，
湖南 长沙 410128）摘 要：长链非编码RNA （lncRNA ）曾经被人们认为是转录过程中的“垃圾”，翻译过程中的“噪声”。
但越来越多的研究发现其在转录的整个过程中具有调控作用，可以参与细胞内的多种生物学调控。之前，lncRNA 在人类的疾病、细胞分化等方面得到了高度注视和研究，而在家畜上的研究相对滞后，
文章主要综述了lncRNA 的生物学功能及在猪上的研究进展，为lncRNA 在家畜上研究和应用提供参考。
关键词：长链非编码RNA ；转录调控；内源竞争RNA
长链非编码RNA 在1990年被发现，其转录物缺少长的开放阅读框和与翻译关联，表明RNA 本身是功能性的，而不是编码的蛋白质产物[3]。同样，对X 染体失活至关重要的Xist 也在1991年被发现，并被报道也同样缺乏编码蛋白能力[4]。而此时研究水平也仅仅是停留在不具有编码蛋白能力的RNA 。当人类基因组的序列在2001年发表时，其后续的研究结果表明只有大约1.1%的编码蛋白序列，而其他的均视为非编码序列，其大约24%和75%的分别属于内含子和基因间非编码序列[5]。在2002年，日本科学家在对小鼠的
全长cDNA 进行人工注释，在这个过程当中确定了其大部分为核酸序列较长的非编码RNA ，由此拉开了长链非编码RNA （lncRNA ）的序幕[6]。尤其是在基因组测序技术的飞速发展的带动下，整个转录组学的研究进展也得到了快速发展。利用高通量测序技术，使得大量的lncRNA 被陆续发现。
1 LncRNA 定义与分类
LncRNA 通常被定义为长度超过200个核苷酸连接的内源性细胞RNA 分子，具有顺式或反式调节功能[
7]。与mRNA 相比，lncRNAs 在其大小、特异性、组织和亚细胞定位方面呈现出不同的特征。但它们也具有与mRNA （生物发生和形式）的许多相似性，其结构上也类似于mRNA 。与已知蛋白编码功能和具有翻译潜力的mRNA 不同的
Research progress of LncRNA in pig
Yan Gong, Haiming Ma
叶村叠罗汉(College of Animal Science, Hunan Agricultural University , Changsha, Hunan 410128, China)
Abstract: Long-chain non-coding RNA has been considered to be "junk" during the transcription or "noise" in the translation process, but more and more studies have found that it plays a regulatory role in the whole process of transcription and can participate in a variety of biological regulation in cells. Before that, lncRNA has been highly concerned and studied in human diseases, cell differentiation and so on, but the research in livestock is relatively lagging behind. In this paper, the biological function of lncRNA and its research progress in pig are reviewed, which provides references for the research and application of lncRNA in livestock.
Keywords: Long chain non-coding RNA; Transcription regulation; Competing endogenous RNA
基金项目：湖南省自然科学联合基金项目（2018JJ4003）；宁乡花猪肉基础研究技术开发项目
（15430701001480）
作者简介：龚龑（1979-），男，湖南岳阳人，博士研究生。*************************通信作者：马海明，博士，教授，博士生导师，E-mail:*********************
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荷花淀赏析
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是lncRNA 缺乏具有显著长度和质量的开放阅读框（ORF ），而被视为不具备编码蛋白能力。与mRN
A 相比而言，lncRNA 长度较短，表达量也很低[8]。这些较低的表达水平也使得lncRNA 最初被人们认为其仅仅是转录“垃圾”和翻译“噪声”的主要原因。在机体绝大多数的组织中的表达均比mRNAs 低，但在睾丸组织中却表现为组织特异性的高表达水平。哺乳动物表达的lncRNA 在组织特异性方面表现出非常强的保守性，并且lncRNA 在启动子和外显子中表现出更高的初级序列保守性，与因组织特异性功能而丰富的蛋白质编码基因更接近，重复元件较少，单外显子转录频率更高[9]。与蛋白质编码基因相比，许多lncRNAs 的表达方式更具有组织特异性，组织间差异更大[10]。蛋白编码基因的外显子和内含子的鸟嘌呤-胞嘧啶（GC ）含量显著高于lncRNAs ，且lncRNAs 的单核苷酸多态性（SNP ）密度显著高于蛋白编码基因。保守性分析表明，大多数lncRNAs 在猪、人和小鼠中具有进化保守性，如CUFF.253988.1，与人的lncRNA -MALAT1具有同源性[11]。同时在骨骼肌中还发现的lncRNAs 启动子甲基化可以负调控lncRNAs 的表达，然后正调控靶基因的表达[12]。
一些保守非编码序列参与哺乳动物近端蛋白编码基因的调节，但也有研究认为保守非编码序列与蛋白编码基因的接近可能对调节作用并不重要。比如在绵羊中，20%～30%的lncRNAs 位于蛋白编码基因附近，与其强共表达，这与增强子序列中某些非编码RNAs 的进化起源相一致。而大多数的lncRNA 并不与邻近的蛋白编码基因共同表达[13]。非编码序列与其最近的蛋白质编码基因之间的物理距离在人类基因组和小鼠基因组之间都有很好的保守
性，其邻近基因常出现在进化保守的基因组附近。一些新的数据提示保守的非编码序列更可能是调控
首都休闲大学元件，而这与基因间lncRNAs 不同。这也预示lncRNA 与其他非编码序列在功能上存在差异[14]。
深度测序技术的进步使得大量的新转录本不断出现，使得lncRNA 的分类需要一个统一的规范的标准。LncRNAs 主要根据其长度、生物发生途径、特定生物学过程、与已知编码蛋白基因的位置、调控元件及位点、亚细胞定位及起源、功能来分类。遗憾的是目前分类尚不规范，最常用的分类方式是依据与编码蛋白基因的位置而划分，可以高度概括地将lncRNA 分为3类（见图1），由基因间转录得到的长链非编码RNA 为 基因间lncRNA （intergenic lncRNA ）；由编码蛋白质的基因中的内含子转录得到的长链非编码RNA 为内含子lncRNA （intronic lncRNA ）；由编码蛋白基因的反义链转录得到的长链非编码RNA 为反义lncRNA （antisense lncRNA ）。
2 LncRNA 的作用机理
非编码RNA 曾经被人们认为是翻译“噪声”的一部分，随着现代分子生物学的发展，非编码RNA 在转录和转录后基因调控中成为了一个新的研究的调控因素。在基因调控的各个方面，包括表观遗传调
控、X 染体失活、基因组印迹、转录和mRNA 剪接等，都能体现非编码RNA 的调控功能。在对哺乳动物细胞和组织的转录学研究中发现超过三分之二的哺乳动物基因组被转录编码成大量的不同类别的长度不同的非编码RNAs 。其中lncRNAs 是非编码RNA 中最大的一类，在转录本的数量上甚至超过了编码蛋白质的mRNAs 。在细胞增殖、细胞周期、代谢、凋亡、分化等广泛的生物学过程中，lncRNA
ttv
s 成为关键的调节因子。其不仅表现出对基因的调控，而且还通过不同的机制来发挥它们的作用。
混合所有制与国企改革新思路
2.1 LncRNA 对染质转录调控
LncRNAs 已成为调控染质转录的关键分子。lncRNAs 在不同的功能阶段调控染质结构，包括组蛋白修饰、DNA 甲基化和染质重塑。LncRNA 具有较小的进化保守性、较少的丰度和更多的组织特异性，说明它们的转录前调节不同于mRNA 的转录和转录后调节。相比于mRNA 而言，lncRNA 启动子缺乏转录因子（TF ）结合位点，却富集了如GATA 和FOS 等特定的因子。lncRNAs 和mRNAs 之间的区别还在于剪接。LncRNAs 的剪接效率较低，主要原因可能是u2af65结合度较低，剪接相关结构较弱[15]。
LncRNAs 可以与组蛋白修饰复合物相互作用，lncRNA-Xist
是一种
图1 LncRNA 的分类
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从雌性染体中不活跃的X 染体中高表达的lncRNA ，在X 染体在失活前表达，其长度在17 kb 左右，可以与两个多梳抑制复合物PRC1和PRC2相互作用，尤其是PRC2可以介导组蛋白H3（H3K27ME ）上的27位赖氨酸的甲基化，沉默基因的表达，进而导致哺乳动物的X 染体失活（见图2）。lncRNA-HOTAIR 是在HoxC 基因簇中转录产物，靶向PCR2复合物和组蛋白H3K4me1/2脱甲基酶LSD1，反式调控转录基因沉默，作用机制与lncRNA-Xist 类似[16]。通过与PRC2复合物作用调控基因表达的lncRNA 还有很多，如Pint [17]，Bvht [18]，Fendrr [19]，SRA [20]等。而lncRNA-FAL1[21]和lncRNA-ANRIL [22]则通过与PRC1复合物作用，调节相邻的靶基因的表达。
除了与组蛋白修饰酶和共价修饰染质相互作用外，lncRNAs 还可以与染质重塑复合物有关联，以调节基因表达[24]。LncRNA-SChLAP1与染体重塑复合物SWI/SNF 对人体的前列腺癌细胞就有调
控作用。lncRNA-SChLAP1基因敲除后可以抑制癌细胞的侵袭和增殖，而SMARCB 1（SWI/SNF 复合物的组分）的敲除则促进了肿瘤的发育，说明在对前列腺癌细胞的调控作用中两者的相反作用。此外，
SChLAP1与SWI/SNF 复合物的SNF5亚基相互作用并且对SWI/SNF 复合物的全基因组定位和调节功能产生抑制作用，从而导致基因活性在全基因组的抑制[25]。通过与染体重塑复合物SWI/SNF 的相互作用来调控基因的lncRNA 有诸如Evf2[26]，Mhrt [25]等。LncRNAS 和SWI/SNF 复合物在基因的调控中既有相互颉颃的作用又有介导基因激活的功能。lncRNA-TCF7通过激活Wnt 信号来促进人类肝脏癌症干细胞的自行更新，招募SWI/SNF 复合物并与之相互作用来调控TCF7启动子，以此激活TCF7的表达和Wnt 信号[27]。2.2 LncRNA 在基因印记中的调控
基因印记是指在二倍体哺乳动物的等位基因中，分别来自于父本和母本，但是在遗传过程中只有一个遗传亲本的基因具有活性，而另一个来自亲本的等位基因则维持在非活性当中。遗传的亲本等位基因的这种差异表达取决于起源的母体；在某些情况下，基因的等位基因可能是永远印记的，而在其他情况下，它将是母性印记的。印迹通常通过特定基因座的组蛋白或DNA 修饰来实现，最近研究表明lncRNAs 在这一现象中起调控作用。
LncRNA-Airn 长度为108 kb ，属于核局部转录本是从胰岛素样生长因子2型受体（Igf2r ）基因的内含
子2的3.7 kb 印迹控制元件（ICE ）反义方向转录而来，控制着Slc22a2，Slc22a3和Igf2r 这3个基因的亲本特异性表达。ICE 在父本等位基因的缺失使得3个双等位基因的表达，正好与母本等位基因相反。通过在转录起始位点下游插入一个3 kb 的多腺苷酸化信号可以阻断ICE 的反向转录从而表现出与父本等位基因相类似的表型[28]。LncRNA-X i s t 可以与父本染体上的顺式DNA 位点的编码RNA 相互作用，通过一个抑制性组蛋白标记h3k9me3的富集使得scl22a3基因沉默[29]。LncRNA-Kcnq1ot1长度为91 kb ，是由7号染体上的1MBKCNQ1/CDKN1基因座编码转录。同时，在7号染体富含蛋白编码基因。Kcnq1ot1在父本染体上表达，而在母本染体上Kcnq1ot1由于CPG 甲基化使得表达受到了抑制。它在父本染体上的表达与8～10个相邻蛋白编码基因的抑制有关[30]。
LncRNA-IPW 是在人染体15和小鼠染体7上的PWS/AS 印记结构域中表达的基因。PWS/AS 区域的破坏与人类中的3个神经源性疾病有关。通过确定IPW 基因的牛同源性，显示了在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、脾脏和骨骼肌中IPW 的复合物和组织特异性表达模式。通过基因组DNA 测序，确定了长外显子h 区的单核苷酸多态性，通过对杂合子个体的cDNA 序列分析，证实了IPW 的单等位基因表达，表明IPW 可能在牛体内有印迹作用[31]。通过位于牛21号染体dlk1-dio3印迹簇中的牛me8基因的cDNA 序列，并发现了3个新的lncRNAs ，分别命名为Meg8-IT1、me8-IT2和me8-IT3，在成年牛8个组织中均有表达，类似于Mg 8的表达模式。在这3个lncRNAs 中发现了3个单核苷酸多态性位点，在被分析的组织中表现出单等位基因表达，说明它们可能是在牛
图2 组蛋白修饰[23]
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体内印迹[32]。
2.3 LncRNA 对转录后的调控
一些lncRNA 的序列与miRNA 的序列为互补序列，当lncRNA 与miRNA 相互结合时，便可以阻止miRNA 与目标mRNA 的结合，起到了颉颃作用，由于lncRNA 像海绵一样吸住mRNA ，所以将此作用
被称之为“海绵”效应（见图3）。LncRNA 还参与了骨骼肌卫星细胞的增殖和分化调控。新的lncRNA -lnc133b ，它由完全成熟的mir-133 b 所补充，这表明lnc133b 可能通过对mir-133 b “海绵”作用来调控mir-133 b 的表达。lnc133 b 与miR-133b 在miR-133b 互补的区域中相互作用，过度表达或抑制lnc133b 可促进卫星细胞的增殖或抑制分化。lnc133b 对mir-133 b 的表达具有负调控作用，对IGF1R 基因表达具有正调控作用，说明lnc133b/mir-133b/IGF1R 轴是一种通过内源竞争RNA （ceRNA ）机制促进卫星细胞增殖和抑制其分化的潜在途径[33]。同样在人类成骨细胞分化过程中lncRNA-h19也有miRNA-141和miRNA-22的结合位点，其作用机理与lncRNA -lnc133b 相似[34]。Lnc-H19在各个年龄段的骨骼肌中均高度表达。H19的高表达对于牛卫星细胞的分化是必需的。H19的敲除引起成肌细胞抑制基因SIRT1/FOXO1的表达显著增加，这表明H19在肌生成过程中抑制SIRT1/FOXO1基因表达。用SIRT1或FOXO1与含有H19的pcDNA 载体共转染，在SIRT1/FOXO1过表达后发现抵消了成肌细胞的促分化作用，说明H19通过抑制SIRT 1/Foxo 1促进牛骨骼肌卫星细胞的分化[35]。
而l n c R N A 在对m i R N A 作用时，对miRNA 的靶向mRNA 起到的保护作用的同时，lncRNA 还可以直接对mRNA 的衰减有调控作用。mRNA 3’UTR 中的顺式调节元件也可以影响mRNA 的稳定性，其中lncRNA 可以通过STAU 介导mRNA 衰减。STAU1是一种蛋白质效应器
通过分子间或分子内碱基配对与双链RNA 结合。而lncRNAs 在其碱基对序列中含有ALU 元件，通过与目标mRNAs 的3’UTRs 部分序列互补，从而激活STAU 介导的mRNAs 衰减（见图4）[36]。
3 LncRNA 在猪上的研究进展
长链非编码RNA 通过对基因印记、染质重塑、剪接调控、细胞分化调控、mRNA 降解和翻译的调控来发挥其生物学功能。它们从转录“噪声”到人们认识成为新的基因表达调控因子，在基因调控的各个方面，包括表观遗传调控、X 染体失活、基因组印迹、细胞核和细胞质贩运、转录和mRNA 剪接等方面都发挥了调控作用。尤其近来，关于lncRNA 的研究成为热点，主要集中在人和小鼠上，关于lncRNA 对神经性疾病、肿瘤[37]、胚胎发育、细胞分化等方面的影响[38]。而在家畜上的研究相对滞后。目前，LncRNA 在家畜上的研究主要集中在细胞分化、脂肪合成、胚胎及肌肉发育方面的调控[39]。尽管它们缺乏编码能力，但许多lncRNAs 在各种生物过程中都发挥着功能作用，这为基因组复杂的结构组织和功能增加了一个新的调控网络[40]。3.1 与繁殖相关的lncRNA 研究
Wa n g Z 等鉴定了约克夏和梅山猪的猪卵巢组织中表达的lncRNAs ，其中有510个是卵巢特异性的，192个存在约克郡和梅山猪的差异表达，38个是卵巢特异性和差异表达的。通过分析它们最近的蛋白编码基因可以预测它们的功能，以此研究梅山猪的高繁殖力[41]。而松果体可以调节神经分泌和生殖功能，具有很强的生物节律性，尤其是对生殖激素分泌的调节尤为重要。通过在仔猪、青年猪和成年猪3个阶段采集松果体样本进行分析发现了8 166个新的lncRNAs 。其中851个lncRNAs
在成熟过程中表现出显
图3 lncRNA 对miRNA 的“海绵”效应[23]
图4 Staufen 介导的mRNA 衰减[23]
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著的动态调节功能，而同源核基因的表达没有显示出显著差异。GO 分析表明差异表达的基因在离子传递和突触传递中明显富集，强调了钙信号在松果体发育过程中起着关键作用。证明lncRNA 动态调节发育进而影响松果体生理学功能[42]。3.2 与疾病相关的lncRNA 研究
PDCoV （猪德尔塔冠状病毒）是一种新型的猪冠状病毒，具有高度传染性，可引起仔猪肠道坏死、肠壁变薄和小肠严重绒毛萎缩。临床表现为腹泻、脱水和呕吐。而lncRNA 对病毒的复制和毒力的增强或降低有显著的影响。从哺乳仔猪水样腹泻粪便中分离和保存的病毒株，感染ST 细胞，然后利用高通量测序筛选PDCoV 感染期间差异表达的lncRNA ，在感染的早、中、晚三个时期分别鉴定了99、41
和33个差异表达的lncRNAs ，参与糖酵解/糖异生、组氨酸代谢以及戊糖、氯烷烃和氯烷烃降解途径。通过获得了PDCoV 感染过程中miRNAs 、lnc RNAs 和mRNAs 的表达数据，构建了一个互作网络[43]。
给仔猪添加喹赛多时，发现在仔猪肝脏中差异表达新的lncRNA-CRNG ，位于11号染体中，含有953个核苷酸，主要分布于细胞质中。CRNG 显著增加了KITLG 、FOXP3和miR-451，并降低ANPEP 和S TAT 5a m R N A 的表达，表明CRNG 直接调节炎症反应，可能是炎症、病原体感染和抗病毒免疫的重要调节因子[44]。
在猪不同发育过程中，大多数lncRNAs 和mRNA 具有相似的时间表达模式，这表明它们之间的表达相关性和功能相关性。大多数基因在哺乳期有低水平表达，但在发育后期阶段处于较高水平。在哺乳期，发现几个与T 细胞相关基因的表达连续增加，表明这些基因对于在这一阶段的仔猪中建立适应
性免疫系统至关重要的。值得注意的是，LncRNATCONS-00086451可通过上调激活T 细胞胞浆2（NFATC2）表达的核因子来促进基于血液的免疫系统发育[45]。
通过对180日龄和8岁的母猪的大脑皮层进行全转录组分析，鉴定了714个mRNA 、38个lncRNA 、41个miRNA 和148个circRNA 与年龄相关的基因。由于非编码RNA 的表达水平变化，导致lncRNAS 、miRNA 和circRNA 对不同年龄阶段的猪脑有影响。上调基因对应激反应、生殖调控过程、免疫应答和
代谢过程均有显著的富集作用，下调基因与神经功能、应激反应和信号传导途径有关。突触传递通路可能在猪脑老化过程中起关键作用，对于差异表达的mRNAs 和lncRNAs 都是共富集的。此外，在脑老化过程中，一些lncRNAs 及其靶基因也有差异表达[46]。
3.3 与生产性能相关的lncRNA 研究
种植牙周围的组织重建肌肉生长和脂肪沉积是猪生长发育中两个重要的生物学过程，与猪的生产性能密切相关。中国地方品种与外来品种也有许多差异，地方品种中脂肪型猪种较多，而外来品种中以杜洛克、长白和大白种为瘦肉型猪的主要代表。
大白猪肌肉生长速度高于马身猪。比较了这两个猪品种在1、90、180日龄骨骼肌中lncRNA 的表达谱，鉴定了5 153个新的lncRNAs ，发现1 407个差异表达lncRNAs 在 两个品种之间有一致的表达模式[47]。Chen G 等采用白杜洛克和二花脸猪杂交的全同胞雌性个体240日龄的肝脏、腹部脂肪和背最长肌，鉴定出与猪肌肉生长和脂肪沉积相关的581个lncRNAs ，与其他哺乳动物lncRNA 共同特征，GO 分析lncRNA 的靶基因参与猪肌肉生长和脂肪沉积相关的过程，包括肌肉细胞增殖、脂代谢和脂肪酸降解。其中
MRPL12与肌肉生长相关，GCGR 和SLC25A10H 与脂肪沉积相关，PPP3CA 、DPYD 和FGGYA 不仅与肌肉生长有关，而且与脂肪沉积有关[48]。松辽黑猪和长白猪在生产和肉质性状上表现出重要的
差异，包括脂肪沉积和肌肉发育。通过RNA 测序技术鉴定脂肪组织中差异表达的基因。共鉴定出1 071个lncRNAs ，其中85个lncRNAs 差异表达，其中53个上调，32个下调，涉及胰高血糖素信号转导途径、糖酵解/糖异生作用、胰岛素信号传导途径、MAPK 信号传导途径等。发现提示IncRNA mstrg.2479.1可能调节极低密度脂蛋白受体基因的表达水平，进而影响猪脂肪代谢[49]。
杜洛克猪相比陆川猪背脂厚度有显著差异。鉴定了4 868个lncRNA 转录本（包括3 235份新转录本），确定lncRNAs 和mRNAs 的差异表达模式具有很强的组织特异性。在脂肪组织中差异表达的lncRNAs 有794个潜在的靶基因，涉及脂肪细胞因子信号通路、PI3K-AKT 信号通路和钙信号通路。此外，差异表达的lncRNA 定位于13个脂肪相关的数量性状位点，其中包括65个QTL_ID 。进而探寻了两个品种间脂肪代谢差异背后的机制[50]。对去势和未去势的淮南雄性猪的皮下脂肪组织进行RNA 测序，鉴定了皮下脂肪组织中的lncRNAs 。同时，从皮下脂肪组织中鉴别出343个lncRNAs ，包括223个基因间lncrnas （lincrnas ）、68个反义l n c r n a s 和52个内含子lncrnas 。其中13个促进脂肪生成miRNA 和5个抑制脂肪生成miRNA 靶向lncRNAS 。功能分析表明，这18个lncRNAs 及其靶基因参与了脂肪酸、胰岛素和脂肪细胞因子信号通路。lncRNAs 及其靶基因可能参与了去势诱导的脂肪沉积，为对抗睾酮缺乏症相关肥胖提供了新的靶点[51]。
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