·论著·
中国医药导报2018年7月第15卷第19期
[基金项目]湖南省自然科学基金资助项目(08JJ3032)；湖南省卫生厅科研计划项目(B2007100)。
[作者简介]肖婷焱(1991.1-)，女，硕士；研究方向：肝癌的发病机制。
[通讯作者]曾斌(1969.12-)，男，博士，主任医师，副教授；研究方向：肝癌的发病机制。周寿红(1976.9-)，男，博士，副教授；研究方向：神经退行性疾病及肝纤维化的防治。医患法律关系
肝细胞癌(简称“肝癌”)是原发性肝癌的主要类型，其发病率近年来持续攀升，已经成为全球第二大致命性癌症[1-2]。转录激活因子4(activating transcrip⁃tion factor 4,ATF4)是ATF/CREB 家族的成员之一，能够调控适应性关键基因的转录，参与氨基酸的合成与运输、糖脂代谢及整合应激反应等多种生物学功 能[3-4]。ATF4通路在诱导肿瘤细胞凋亡、调节肿瘤自噬 中起着关键作用[5-6]。Warburg 效应是肿瘤细胞独特的能量代谢方式,M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase subtype M2,PKM2)是最重要的一种Warburg 效应相关蛋白，在大多肿瘤细胞中呈高表达[7]。本研究旨在探讨过表达ATF4下调Warburg 效应相关蛋白PKM2 表达及对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响。1材料与方法1.1细胞株及试药
人肝癌细胞系HepG2(南华大学微生物研究所)。二甲基亚砜(杭州四季青公司，批号:171014);Lipo⁃fectamine 2000(美国Invitrogen 公司，批号:1705567);
ATF4质粒及空载质粒(上海吉凯基因公司，批号:170506)；质粒小提试剂盒(北京天根生物技术公司，批号:1701016);Loading-Buffer 上样缓冲液(北京碧 ATF4过表达对HepG2细胞凋亡的影响及其机制
肖婷焱1
段无暇1
许紫薇1
周寿红2
曾
斌1
1.南华大学附属第一医院消化内科，湖南衡阳421001;
2.南华大学医学院生理学教研室，湖南衡阳
421001
[摘要]目的观察转录激活因子4(ATF4)过表达对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响，并探讨其机制。方法构建ATF4表达质粒，采用脂质体瞬时转染HepG2细胞。实验分为空白对照组、空质粒组和ATF4质粒组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率，检测HepG2细胞培养液中乳酸含量,Western blot 检测Warburg 效应蛋白M2型丙酮酸激酶(PKM2)的表达。结果与空质粒组比较,ATF4质粒组HepG2细胞凋亡率显著增加，细胞培养液中乳酸含量显著降低,HepG2细胞中PKM2蛋白的表达显著下调(均P <0.05)。结论过表达ATF4促进HepG2细胞的凋亡，其机制可能与抑制Warburg 效应有关。
[关键词]肝细胞性肝癌；细胞凋亡；转录激活因子4;Warburg 效应;M2型丙酮酸激酶[中图分类号]R34
[文献标识码]A
[文章编号]1673-7210(2018)07(a)-0012-05
Effect and mechanism of overexpression of ATF4on the apoptosis of HepG2cells
XIAO Tingyan 1DUAN Wuxia 1XU Ziwei 1ZHOU Shouhong 2ZENG Bin 11.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hu'nan Province,Hengyang
421001,China;2.Teaching and Research Office of Physiology,Medical College,University of South China,
Hu'nan Province,Hengyang
421001,China
[Abstract]Objective To observe the effect of overexpression of activating transcription factor 4(ATF4)on the apopto⁃
sis of HepG2cells and explore the mechanism.Methods ATF4expression plasmid was built.Hepatocellular carcinoma line HepG2cells were transfected with ATF4expression plasmid through liposome.The plasmids were divided into blank control group,empty plasmid group and ATF4plasmid group.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.The content of lactate in cell culture medium was tested.The expression of Warburg effect protein pyruvate kinase subtype M2(PKM2)was measured by Western blot.Results Compared with the empty plasmid group,the apoptosis rate
of HepG2cells increased significantly,the content of lactate in cell culture medium decreased significantly and the ex⁃pression of PKM2decreased significantly (all P <0.05).Conclusion Overexpression of ATF4promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma line HepG2cells,the mechanism may be related to inhibition of Warburg effect.[Key words]Hepatocellular carcinoma;Apoptosis;Activating transcription factor 4;Warburg effect;Pyruvate kinase
subtype M2
中国医药导报2018年7月第15卷第19期·论著·
云天生物技术公司，批号:ST506);BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天生物技术公司，批号:G1712);
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(北京碧云天生物技术公司，批号:p0017s)；流式细胞凋亡检测试剂盒(北京联科生物技术公司，批号:170513);L-乳酸盐检测试剂盒(北京九强生物有限公司，批号:170621);PKM2兔抗人单克隆抗体(美国Cell Signaling公司，批号:170-21);GAPDH兔抗人单克隆抗体(北京博奥森有限公司，批号:bs-0061R)；辣根标记山羊抗兔IgG(北京博奥森有限公司，批号:Zbs0175R)；辣根标记山羊抗鼠IgG(北京博奥森有限公司，批号:Zbs0175R)。
1.2方法
1.2.1细胞培养与分组使用1640培养基培养人肝癌细胞HepG2，培养基含10%胎牛血清。培养条件:37℃, 5%CO2。每1~2天进行细胞换液，当细胞融合度达80%~90%时，进行细胞传代、细胞冻存或用于后续实验。实验分为空白对照组、空质粒组和ATF4质粒组。
1.2.2ATF4过表达质粒的构建及质粒DNA提取ATF4过表达质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，载体名称为GV362。元件顺序:CMV-MCS-3FLAG-IRES-EGFP-SV40-Neomycin；克隆位点: XhoI/BamHI；对照编号:CON236。ATF4过表达质粒构建好后，对目的基因进行阳性克隆测序分析，证明成功构建ATF4表达质粒。以LB粉剂加入一级水配制成LB液，高压蒸汽灭菌备用。细菌操作台内将卡那霉素加入上述LB培养液中。以含质粒(ATF4或空质粒)的菌液分别加入LB培养液中,37℃、180r/min摇床上震荡培养16h。按质粒小提试剂盒中操作说明进行提取纯化质粒用于后续实验。
1.2.3细胞转染HepG2细胞按106个/孔接种于6孔板中，含10%胎牛血清1640培养基培养，待细胞均匀铺满孔板90%时转染。去培养液,PBS冲洗2遍。配制转染混合液:A液为4μg ATF4表达质粒(或空质粒载体)用无血清1640培养基稀释成250μL。B液为10μL Lipofectamine2000用无血清1640培养基稀释成250μL。B液静置5min后，混合A液和B液，混合后静置20min后成为转染混合液。将上述转染混合液按分组加入6孔板内，轻轻晃动混匀，放入培养箱内孵育4~6h后,PBS清洗2遍，加入含10%小牛血清的1640培养基后，置于培养箱中继续培养。48h 后于荧光显微镜下观察绿荧光表达情况，并计算转染率。
1.2.4Annexin V-FITC/PI染和流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin V-PE/7-AAD荧光染法检测细胞凋亡。收集各组HepG2细胞于离心管中，离心半径为55mm,1000r/min，离心5min，弃上清，冷
PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106/mL，将细胞悬于1×结合缓冲液中，加5μL Annexin V-PE和10μL 7-ADD，轻轻混匀冰上避光反应15min，加380μL冷的1×结合缓冲液，重复3次，上机检测。每次计细胞数6000个，记录激发波长488nm处红荧光，流式细胞仪分析不同DNA含量的细胞分布，用分析软件CellQuest检测凋亡率。
1.2.5Western blot检测PKM2蛋白表达HepG2细胞经转染48h后加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30~40h，离心半径为30mm,14000r/min离心10min，收集上清液。BCA法定量蛋白浓度。RIPA 裂解液稀释、配平蛋白，加入Loading-Buffer上样缓冲液。PCR仪中99℃、10min煮沸使蛋白变性。配制好SDS-PAGE凝胶，加入适量蛋白样品至加样孔后电泳。切出目的胶并裁剪相应的PVDF膜，以150mA恒定电流将目的蛋白转至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2h。一抗anti-ATF4(1∶2000)、anti-PKM2 (1∶1000)和anti-GAPDH(1∶2000)孵育过夜。二抗孵育2h。显影。采用Image J软件处理结果并进行数据分析。
1.2.6L-乳酸盐检测试剂盒检测细胞培养液内的乳酸分泌量HepG2细胞按105个/孔接种于24孔板中，培养贴壁，每组设置8个复孔，转染48h后备用。分别收集各孔细胞培养液样品，按乳酸检测试剂盒操作说明检测各样本中的乳酸含量(mmol/L)，记录数据结果。
猎狗追兔子1.3统计学方法
采用SPSS18.0对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多个样本间的数据比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1过表达ATF4的HepG2细胞系的建立
单车 pis
光镜下可见转染后的HepG2细胞形态正常，具有良好的透光度，没有出现明显的大片细胞死亡以及细胞碎片的形成。荧光显微镜下可见转染组EGFP阳性细胞数明显增加，转染效率达到(84.56±5.83)%。见图1。
2.2过表达ATF4对肝癌细胞HepG2凋亡的影响
与空质粒组比较,ATF4质粒组的HepG2细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，而空质粒组与空白对照组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。
·论
著·
中国医药导报2018年7月第15卷第19期
102
103104105FITC-A
空白对照组
空质粒组
102
103104105FITC-A
102
103104105
FITC-A
ATF4质粒组
*
空白对照组
空质粒组ATF4质粒组后退哥
6050403020100
2.3过表达ATF4对HepG2细胞培养液中乳酸含量的影响
与空质粒组比较,ATF4质粒组HepG2细胞培养液中乳酸含量显著减少(P <0.05)，而空质粒组与空
白对照组HepG2细胞培养液中乳酸含量比较，差异无统计学意义(P >0.05)。见图3。
2.4过表达ATF4对HepG2细胞中PKM2蛋白表达的影响
与空质粒组比较,ATF4质粒组HepG2细胞中
PKM2蛋白的表达水平显著下调(P <0.05)，而空质红楼惊梦
粒组与空白对照组HepG2细胞中PKM2蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P >0.05)。见图4。3讨论
肝癌的发生发展受肝癌细胞本身、肝癌与微环境之间相互作用等多方面因素的影响，肝癌的发生伴随着细胞形态变化、功能缺失及细胞代谢的显著改变
等[8-10]。ATF4是一种未折叠反应蛋白，参与多种细胞
生物学功能，其主要功能包括氨基酸的合成与运输、能量代谢、糖脂代谢及整合应激反应等[11]。研究发现ATF4参与调节肿瘤细胞凋亡，影响着肿瘤细胞的发生发展[12]。研究表明,ATF4过表达能诱导大肠癌细胞发生凋亡[13]。Lee 等[14]发现，内质网应激时,ATF4能够
调节黄猩猩果蝇细胞的糖酵解相关基因的表达。研究
表明，过表达ATF4基因的裸鼠横纹肌肉瘤成瘤体积小于野生型裸鼠，表明ATF4能诱导肿瘤细胞发生凋亡，其作用机制可能与诱导下游基因ANSN 表达有关[15]。本研究结果发现,ATF4过表达可促进肝癌HepG2细
A：荧光显微镜自然光下所见;B：荧光显微镜蓝光下所见;ATF4：转
录激活因子4
图1过表达ATF4的HepG2细胞系的建立(Annexin V-PE/7-AAD 荧光染,200×)
A
B
空质粒组
ATF4质粒组
空质粒组ATF4质粒组
与空质粒组比较,*P <0.05;ATF4：转录激活因子4图2过表达ATF4对肝癌细胞HepG2凋亡的影响
与空质粒组比较,*P<0.05;ATF4：转录激活因子4图3过表达ATF4对HepG2细胞培养液中乳酸含量的影响与空质粒组比较,*P<0.05;ATF4：转录激活因子4
图4过表达ATF4对HepG2细胞中PKM2蛋白表达的影响
胞发生凋亡。但是ATF4的作用机制尚不完善，其作为未折叠蛋白因子影响肿瘤细胞的功能已经比较明确，但ATF4在通过调节代谢通路而影响肿瘤方面的作用尚不清楚，因此,ATF4作为肿瘤代谢调控因子的功能有待进一步探讨。
Warburg效应是肿瘤细胞代谢的主要标志之一，即细胞在氧充足的条件下仍以糖酵解为主产生大量乳酸。许多肿瘤组织中都能观察到Warburg效应，包括肝癌、结肠癌、肺癌、恶性胶质细胞瘤等[16]。研究显示，下调Warburg效应相关蛋白的表达能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡[17]。Warburg效应能够促进肿瘤细胞增殖，有氧糖酵解影响肿瘤发展、迁移及等多方面，抑制肿瘤细胞的有氧糖酵解表型能够促进肿瘤细胞凋亡[18]。
缺省
Warburg效应包括丙酮酸激酶等酶基因在内的多个作用靶点，这些作用位点统称为Warburg效应相关蛋白，调节这些酶基因表达都能直接影响Warburg 效应。丙酮酸激酶有四种表型,PKM2是其中最主要的肿瘤表型。通常来说,PKM1主要存在于非增生性组织中，而PKM2则为增殖性组织中所特有。PKM1向PKM2表型的转换是PKM2在许多癌症细胞中呈高表达的主要原因，这说明Warburg效应相关蛋白
PKM2具有致瘤性。研究显示,PKM2促进结肠癌细胞的增殖及迁移，并且能够介导Warburg效应的建立，是Warburg效应的重要标志物[19-20]。然而ATF4是否对肿瘤Warburg效应有调节作用尚未见报道。本研究结果发现，过表达ATF4可下调HepG2细胞PKM2的表达，减少肝癌HepG2细胞乳酸生成，表明过表达ATF4可抑制肝癌HepG2细胞Warburg效应。因此推测过表达ATF4可促进肝癌HepG2细胞凋亡的机制可能与抑制Warburg效应有关。
[参考文献]
[1]Marquardt JU,Andersen JB,Thorgeirsson SS.Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer[J].Nat Rev Cancer,2015,15(11):653-667. [2]纪龙珊，孙学华，周振华，等.肝细胞核因子4α与肝细胞
癌关系的研究进展[J].中国医药导报,2018,15(2):32-35.
[3]Teske BF,Wek SA,Bunpo P,et al.The eIF2kinase PERK and the integrated stress response facilitate activation of ATF6during endoplasmic reticulum stress[J].Mol Biol Cell,2011,22(22):4390-4405.
[4]Rouschop KM,van den Beucken T,Dubois L,et al.The unfolded protein response protects human tumor cells dur⁃ing hypoxia through regulation of the autophagy genes MAP1LC3B and ATG5[J].J Clin Invest,2010,120(1): 127-141.
[5]Rozpedek W,Pytel D,Mucha B,et al.The Role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP Signaling Pathway in Tumor Progression During Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Curr Mol Med,2016,16(6):533-544.
[6]Chir WB,Maurin AC,Carraro V,et al.The eIF2α/ATF4 pathway is essential for stress-induced autophagy gene expression[J].Nucleic Acids Res,2013,41(16):7683-7699.
[7]Liu T,Yin H.PDK1promotes tumor cell proliferation and migration by enhancing the Warburg effect in non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2017,36(1):193-200.
[8]周彬，陈志浩，宫绪萌，等.骨髓干细胞移植肝细胞
癌的研究进展[J].中国医药导报,2014,11(22):151-153.
[9]Hutter LH,Rata S,Hochegger H,et al.Interlinked bistable mechanisms generate robust mitotic transitions[J].Cell Cycle,2017,16(20):1885-1892.
[10]孙丹妮，黄洵.NF-κB在肝细胞癌发生发展中的作用及
其机制研究进展[J].中国医药导报,2016,13(18):42-45.
*
空白对照组空质粒组ATF4质粒组
空白对照组空质粒组ATF4质粒组38kD 60kD
PKM2
GAPDH
空白对照组空质粒组ATF4质粒组
*
(下转第29页)
光谱仪，相对峰强度的统一是实现方法转移的关键。本研究通过方法转移，使建立的快速筛查方法具有更广泛的适用性，增加了方法的应用范围，可满足不同情况的监管需求。
综上所述，本文所建立的拉曼光谱方法能够实现紫杉醇固体脂质体制剂的快速筛查，方法对注射用紫杉醇脂质体进行的定性鉴别直接输出判定结果，而无需谱图解析，对使用人员要求低，实用性强。使用长焦距光纤探头的便携式拉曼光谱仪可直接用于抗癌类贵重药品的隔包装检测，简单快速，结果可靠，尤其适合贵重药品和现场检测。方法亦可转移到实验室用多种拉曼光谱仪上使用，实现定性鉴别。因此，本文所建的方法为一种通用的紫杉醇脂质体制剂快速筛查手段，具有广泛的适用性和较高的实用性，能为抗癌类贵重药品的监管和公安打假提供一种简便、可行、科学的方法。
志谢：感谢江苏省食品药品监督检验研究院范青峰主任为本研究提供样品。
[参考文献]
[1]PSI.药品领域案件的发展趋势[EB/OL]./chinese/incidentTrends.cfm
[2]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技
出版社,2015.
[3]张景勍，张志荣.紫杉醇脂质体的制备和质量评价[J].华
西药学杂志,2001,16(1):23-24.[4]国家药典委员会.中国药典[S].四部.北京：中国医药科技
出版社,2015.
[5]赵瑜，尹利辉，曹丽梅，等.拉曼光谱法用于药品注射液
标准中鉴别项的探讨[J].中国药品标准,2015,16(6): 416-420.
[6]ZHAO Y,JI N,YIN L,et al.A non-invasive method for the determination of liquid injectables by Raman spec⁃troscopy[J].AAPS PharmSciTech,2015,16(4):914-921.
[7]赵瑜，纪南，尹利辉，等.液体制剂拉曼无损筛查数据库
的建立[J].药物分析杂志,2015,35(7):134-144. [8]赵瑜，马讯，尹利辉，等.拉曼光谱法快速筛查盐酸哌替
啶注射液[J].中国药学杂志,2016,51(11):529-929. [9]陆彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社, 1998.
[10]赵瑜，尹利辉，纪南，等.消除拉曼光谱仪台间差的方
法：中国,CN201310048251.2[P].2015-08-05. [11]ASTM.Standard Guide for Raman Shift Standards for Spectrometer Calibration[S].ASTM International,E1840-1896.
[12]ZHAO Y,JI N,YIN L,et al.Study on a noninvasive method for rapid screening Human Serum albumin in⁃jectables by Raman spectroscopy[J].Journal of Innova⁃tive Optical Health Sciences,2016,10(1):589-591.
[13]陈涛.脂质体药物制剂的研究现状和前景[J].世界最新
医学信息文摘,2003,2(4):721-728.
(收稿日期:2018-01-25本文编辑：李岳泽)
[11]Al-Baghdadi RJT,Nikonorova IA,Mirek ET,et al.Role of activating transcription factor4in the hepatic re⁃sponse to amino acid depletion by asparaginase[J].Sci Rep,2017,7(1):1272.
[12]Lai DW,Lin KH,Sheu WH,et al.TPL2(Therapeutic Targeting Tumor Progression Locus-2)/ATF4(Activating Transcription Factor-4)/SDF1α(Chemokine Stromal Cell-Derived Factor-α)Axis Suppresses Diabetic Retinopathy[J]. Circ Res,2017,121(6):e37-e52.
[13]Wei J,Yang P,Zhang T,et al.Overexpression of tran⁃scription factor activating enhancer binding protein4 (TFAP4)predicts poor prognosis for colorectal cancer patients[J].Exp Ther Med,2017,14(4):3057-3061.
[14]Lee JE,Oney M,Frizzell K,et al.Drosophila melanogaster activating transcription factor4regulates glycolysis dur⁃ing endoplasmic reticulum stress[J].G3(Bethesda),2015, 5(4):667-675.
[15]León-Annicchiarico CL,Ramírez-Peinado S,Domínguez-Villanueva D,et al.ATF4mediates necrosis induced by glucose deprivation and apoptosis induced by2-de⁃oxyglucose in the same cells[J].FEBS J,2015,282(18):
3647-3658.
[16]Lai JH,Jan HJ,Liu LW,et al.Nodal regulates energy metabolism in glioma cells by inducing expression of hy⁃poxia-inducible factor1α[J].Neuro Oncol.,2013,15(10): 1330-1341.
[17]Gomez LS,Zancan P,Marcondes MC,et al.Resveratrol decreasesbreast cancer cell viability and glucose metabolism by inhibiting6-phosphofructo-1-kinase[J].Biochimie, 2013,95(6):1336-1343.
[18]Guillaumond F,Leca J,Olivares O,et al.Strengthened glycolysis under hypoxia supports tumor symbiosis and hexosamine biosynthesis in pancreatic adenocarcinoma[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(10):3919-3924.
[19]Shang Y,He J,Wang Y,et al.CHIP/Stub1regulates the Warburg effect by promoting degradation of PKM2in o⁃varian carcinoma[J].Oncogene,2017,36(29):4191-4200.
[20]刘新利，张鸿飞，张旭涛，等.生长抑制因子5逆转War⁃burg效应抑制肿瘤增殖的研究[J].中国医药导报,2017, 14(6):4-7.
(收稿日期:2018-02-05本文编辑：张瑜杰)
(上接第15页)
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议