∙ ∙Fluores_cence ∙ ∙ ∙ | 1楼 1、基本原理 在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。 荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。如果将激发光用单器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。 某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。 对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。 2、检测荧光的仪器 测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。 由激发光源发出的光，经激发单器让特征波长的激发光通过，照射到样品杯里的样品使荧光物质发射出荧光，再经发射单器对待测物质所产生的荧光进行分光或者过滤，使特征荧光照射到检测器（一般使用光电倍增管）产生光电流，经电路放大、AD转换、数字处理等方式显示出相应的荧光值。<?xml:namespace prefix = v ns = "urn:schemas-microsoft-com:vml" /> 显示系统 仪器的主要部件介绍： 杂志创刊词 1.激发光源：连续氙灯、脉冲氙灯、单波长的LED灯、高压汞灯、溴钨灯、特殊专用时也可以使用氘灯。目前市场上的中高端荧光分光光度计一般都使用氙灯，如日立的F4500、F4600、F7000，上海棱光技术有限公司的F96Pro、F97、F97Pro、F97XP，天津港东的F380、F320、F280等等用的就是连续氙灯；脉冲氙灯有瓦里安的一款型号在使用；LED灯作为激发光的主要有上海棱光技术有限公司的F96S、F95S、F93等荧光分光光度计。其他光源作为激发光来使用的相对较少。 2.激发单器：其作用是帅选出适合样品的激发光。激发单器主要有滤光片模式和光栅模式：使用滤光片的结构相对简单，但是可选用的激发光源稍少；使用光栅模式的单器结构就比较复杂，但是相应的可选的激发光就比较多。 3.发射单器：其作用是用来分析样品发射出来的荧光。发射单器也有滤光片模式和光栅模式。使用滤光片模式的仪器可检测的样品单一，一般用于专用的荧光仪；使用光栅模式的仪器一般是通用仪器，可以根据不用样品发出的荧光做出相应的分光。光栅结构的仪器一般结构比较复杂，无论是激发单器还是发射单器，都要求有比较高的精度。 | |
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∙2011-04-15 13:45 ∙回复 | ||
∙ ∙Fluores_cence ∙ ∙ ∙ | 2楼 什么是两脚离合器 4.接收系统：荧光分光光度计的接收器一般使用光电倍增管来接收样品发出的荧光。这是因为荧光的信号一般都很微弱，使用其他的如光电池接收器来接收荧光效果比较差。荧光的一个重要指标就是信噪比，使用其他的接收器会对这项指标产生比较大的影响。 5.显示系统：以前有指针式，现在主要有LED数码管、液晶显示。高端的如日立的F4500、F7000和上海棱光的F97系列荧光分光光度计都没有显示系统，他们主要通过联接电脑PC机来进行操作。 2011优酷影视盛典 6.样品系统：样品系统是否齐全是可以影响一款仪器的应用范围的，功能齐全的样品系统可以更有效地发挥出仪器应有的功能。 enthalpic3、荧光分析法的定性和定量 1.定性分析 荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光发射光谱两种。在分光光度法中，被测物质一般只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出多种特征光谱，因此，其鉴定物质的可靠性较强。当然，必须在标准品对照下进行定性。 近年来发展起来的三维荧光法也是一种比较有效的定性方法。通过仪器扫描样品的三维荧光图谱指纹信息可以得出更多更有效地信息，使得更精确地对样品进行分析。 2.定量测定 荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。 （1）直接测定法：利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测定法。某些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。具体方法有两种。 直接比较法：配制标准溶液的荧光强度Fx，已知标准溶液的浓度Cs，便可求得样品中待测荧光物质的含量。 如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度F0，然后进行计算。 标准曲线法：将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。 为了使各次所绘制的标准曲线能重合一致，每次应以同一标准溶液对仪器进行校正。如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则必须改用另一种稳定而荧光峰相近的标准溶液来进行校正。例如，测定维生素B1时，可用硫酸奎宁溶液作为基准；测定维生素B2时，可用荧光素钠溶液作为基准来校正仪器。 （1）间接测定法：有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低，仅能显现非常微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法。 间接测定方法有以下几种： 化学转化法：通过化学反应将非荧光物质变为适合于测定的荧光物质。例如金属与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物。有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。 荧光猝灭法：这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光化合物的荧光猝灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度。 敏化发光法：对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太弱而无法检测，可使用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。阴离子表面活性剂 上述三种方法均为相对测定方法，在实验时须采用某种标准进行比较。 4、减少测量误差的方法 1. 溶剂：溶剂能影响荧光效率，改变荧光强度，因此，在测定时必须用同一溶剂。否则荧光强度基本没有可比性。 2. 浓度：在较浓的溶液中，荧光强度并不随溶液浓度呈正比增长，如石油样品，浓度过高了荧光强度反而迅速下降。因此，必须出与荧光强度呈线性的浓度范围。 3. 酸度：荧光光谱和荧光效率常与溶液的酸度有关，如罗丹明B样品，当溶剂是水的时候，水的PH值会很明显的影响其荧光强度和稳定性。因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH值范围。 4. 温度：荧光强度一般随温度降低而提高，因此，有些荧光仪的液槽配有低温装置，使荧光强度增大，以提高测定的灵敏度。在高级的荧光仪中，液槽四周有冷凝水并附有恒温装置，以便使溶液的温度在测定过程中尽可能保持恒定。 5. 受光时间：有些荧光化合物需要一定时间才能形成；有些荧光物质在激发光较长时间照射下会发生光分解。因此，过早或过晚测定荧光强度均会带来误差。必须通过条件试验确定最适宜的测定时间，使荧光强度达到量大且稳定。为了避免光分解所引起的误差，应在荧光测定的短时间内才打开光闸其余时间均应关闭。 6. 共存干扰物质：有些干扰物质能与荧光分子作用使荧光强度显著下降，这种现象称为荧光的猝灭（quenching）；有些共存物质能产生荧光或产生散射光，也会影响荧光的正确测量。故应设法除去干扰物，并使用纯度较高的溶剂和试剂。 5、荧光上转换 上转换现象是一种特殊的现象。它是通过使用长波长的单激光来激发样品，发射出来的荧光波长比激发光的波长还要短的一种现象。通过这个方式可以实现长波长激发得到短波长的荧光。上转换材料是一门前沿学科，其应用领域也在迅速发展当中。 6、国内外的主要荧光分光光度计产商 1. 上海棱光技术有限公司的F97、F96系列等荧光分光光度计。 2. 天津港东的F380、F320、F280等荧光分光光度计。 3. 天美代理销售的日立F系列荧光分光光度计。 4. 安捷伦科技有限公司的Cary Eclipse荧光分光光度计。 5. 岛津RF-5301PC荧光分光光度计。 | |
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