高效液相谱法
（一）概述
高效液相谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）又称高压液相谱法
柱效高：使用键合固定相，分离效率高。 ♠ 柱效（理论塔板数）：100000/m
灵敏度高：使用高灵敏度检测器（紫 外、荧光、电化学等）。 自动化程度高：可自动采集和处理数据。同时，可以调整和选择分析条件。
高效液相谱法：在气相谱法的理论和实验技术基础上发展起来的分析方法，与气相谱法有若干异同点。
高效液相谱法不受样品挥发性和热稳定性的影响，只要把样品制成溶液便可进行分析。 一些生物大分子可应用高效液相谱法进行分析测定。
高效液相谱法：流动相可选用不同极性的液体，参与对组分的分配作用， 分离效率得以提高。
高效液相谱法的缺点：
推他网★ 使用有机溶剂，使用费用较高，对操作者的健康和环境有不利影响。
★ 仪器较复杂、价格较高。
（二）高效液相谱仪
高效液相谱仪的组成：
高压输液系统 — 进样系统 — 分离系统 — 检测系统 — 记录和数据处理系统
一、高压输液系统
一般由
贮液器、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是高效液相谱仪的核心部件。
高压输液泵: 高效液相谱使用的固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，很难较快流动。
高压输液泵：提供动力，以便流动相被连续不断地送入谱柱。
要求： （1）密封性好，耐腐蚀； （2）有足够的输出压力，使流动相能顺利通过谱柱； （3）输出压力平稳，脉冲小；（4）输出流量恒定，可调范围宽，其流 量精度在1%2%之间； （5）泵室体积小（＜ 0.5 ml），易于清 洗，便于迅速更换溶剂。
高压输液泵分为恒流泵和恒压泵。
恒流泵：输出流量恒定，不受谱柱阻力和流动相粘度等因素的影响。
恒压泵：输出压力恒定，而流量则随谱系统阻力的变化而变化，因此保留时间的重现性差。
恒流泵：柱塞往复泵
柱塞往复泵的泵室体积小（仅几毫升） 易于清洗和更换溶剂，适合于梯度洗脱操作。 缺点：输出液流脉动大，需要外加脉动阻尼器。
二、进样系统
进样方式 ：注射器和六通阀
注射器的缺点：隔膜的穿刺部分在高压情况下容易漏液，且重现性较差。
六通阀的优点：进样量可由定量管的体积严格控制，进样准确，重现性好，自动化程度高，适合做定量分析。
三、分离系统
昆明闪电
分离系统：谱柱、恒温器及连接管等。
谱柱：高效液相谱仪的核心部件，由柱管和固定相组成。
柱管：耐高压、耐腐蚀的不锈钢管制成，且管内壁要求光洁度很高。
谱柱：分析型和制备型。
分析型谱柱：长10～30cm， 内径2～6mm，直型谱柱，以利于装填和提高柱效。
制备型谱柱：谱柱相对较长， 15～50cm。
为了保持谱柱的性能，通常在分析柱前要使用一个短的保护柱。
保护柱内填充物一般与分析柱中的固定相一致，这样可以将样品和流动相中的有害污染物被保留，延长柱子的寿命。
HPLC：常在室温下进行。由于柱温能显著影响组分的保留值。可配备恒温器 （柱温箱），以保证分析时温度恒定。
四、检测系统
HPLC检测器：通用型和专用型 （选择性）检测器。
通用型检测器：测量的是任何液体都共有的物理量，应用范围广。对溶剂本身有响应，易受温度变化、流量波动等因素的影响，噪声和漂移较大，灵敏度较低，不适于痕量分析。
专用型检测器：仅对被分离组分的物理或物理化学特性有选择性响应，对流动相本身没有响应或响应很小，受外界影响小，灵敏度高。
1.紫外可见检测器
用于检测对紫外及可见光有吸收的物质（应用最广的检测器）
紫外检测器工作原理和结构与一般的紫外分光光度计相同，可分为固定波长、可调节波长和二极管阵列检测器。
固定波长型紫外检测器: 以低压汞为光源，检测波长固定在 254 nm 或 280 nm 。 特点：光学系统结构简单，但灵敏度和应用范围受限。
可调波长型紫外可见检测器: 以钨灯和氘灯为光源，检测波长从190～800 nm 连续可调。 特点：应用广泛。使用的流动相在测定波长下应无吸收。
二极管阵列检测器： 可对整个紫外-可见光谱区波长同时进行检测，获得三维的谱-光谱图形， 对每一个谱峰都给出光谱定性信息。
紫外检测器的特点： ① 灵敏度高，最小检测浓度为10-10 g/ml； ② 线性范围宽； ③ 对温度和流动相流速波动不敏感；可用于梯度洗脱； ④ 应用范围广。
2.荧光检测器
检测原理及仪器结构与荧光分析法相同，可对具有荧光特性的样品定量检测。
特点：选择性好；灵敏度高；对温度和流动相流速的变化不敏感；可以进行梯度洗脱。
3. 电化学检测器
电化学检测器种类较多，有电导、库仑、极谱、安培等检测器。 常用的是安培检测器，是利用组分在氧化还原反应过程中产生的电流来对样品进行检测。 是一种选择性检测器。
4. 示差折光检测器
示差折光检测器是利用纯流动相和含有被测组分的流动相之间折光率的差别进行检测的。操作简便，灵敏度不高，对温度变化敏感。 是一种通用型检测器。
五、辅助装置
脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、 馏分收集等装置均为辅助装置。
梯度洗脱装置：高效液相谱仪中重要的辅助装置。
梯度洗脱： 也称溶剂程序。适用于一些组分复杂的样品的分离。 梯度洗脱装置：低压梯度洗脱装置和高压梯度洗脱装置。
在分离过程中，按一定程序不断改变流动相的配比，使溶剂极性、pH值等改变， 从而改进复杂样品的分离，改善峰形、 缩短分析时间，以提高分离效率。
低压梯度洗脱装置： 结构简单，只需一台高压泵。在常压下将不同溶剂按一定比例混合，然后通过高压泵， 将混合后的流动相送入谱柱中。
缺点：不方便改变流动相的配比，溶剂消耗量大，自动化程度低。
高压梯度洗脱装置： 采用二台或多台高压泵，按设定的流量比例将各种溶剂送入混合室，在高压下 进行混合，然后进入谱柱。
优点：能得到任意形式的梯度曲线，梯度重复性和精度高，自动化程度高。
需要多台泵，仪器造价较高。
（三）HPLC的固定相和流动相
一、固定相
高效液相谱：按分离机理可分为吸附、分配、离子交换、尺寸排阻、亲和谱等。
1.液-固吸附谱固定相
液-固谱所使用的固定相：多数是有吸附活性的吸附剂。
常用：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
1）表面多孔型:
又称薄壳型，是在直径约为30 μm的实心玻璃微球表面涂一层很薄的 孔谱材料（如硅胶、氧化铝等）烧结制成。
特点：传质速度快、填充紧密均匀、渗透性 好、柱效高。但柱容量少、进样量小，需要配
备高灵敏度的检测器。
危机公关论文2）全多孔微粒型：
一种颗粒直径很小的 谱柱填料。
特点：粒度小、孔穴浅、柱效高、容量大， 适合复杂混合物分离及痕量分析。
2.化学键合固定相
化学键合固定相：由液液分配谱发展而来。由固定液和担体组成。 早期：机械涂层固定相，是将固定液机械地涂渍在全多孔微粒型和表面多孔型载体上。
涂渍的固定液易溶解于流动相中，造成固定液流失，导致谱柱上保留行为的改变及被分离样品的污染。 为避免固定液流失，改善固定相的功能， 采用化学方法把有机分子键合到载体或硅胶表面，形成化学键合固定相。
化学键合固定相的优点： ① 传质速度快，柱效高； ② 固定液不流失，增加了谱柱的稳定性和使用寿命；③ 由于可以键合不同性质的官能团，改善固定相的性能，选择性得以提
高； ④ 可以使用梯度洗脱，提高分析效率， 获得好的分离结果。
用于制备化学键合固定相的载体：硅胶
按基团与硅胶相结合的化学键类型，分为酯化型（Si-O-C）和硅烷化型（Si-O-Si- C）等
酯化型：最先用于液相谱的键合固定相，醇与硅醇基（Si-OH）直接进行酯化反应，生成 具有Si-O-C键的固定相。
特点：具有良好的传质特性，但易水解、醇解、 热稳定性差，仅适用于使用不含水或醇、极性小的流动相。
盖革计数管
新疆出血热硅烷化型：利用氯硅烷与硅醇基进行硅烷化反应，生成具有Si-O-Si-C键的固定相。
硅烷化型键合固定相：热稳定性好， 不易吸水，耐有机溶剂。 可在一定温度下、一定 pH 范围内 （2～8）正常工作，应用范围广泛。
按有机基团的性质，可分为极性和非极性键合相。
1）极性键合相
硅胶表面键合极性有机基团的称为极性键合相，因常使用比键合相本身极性小的流动相冲洗，即正相键合相。 流动相极性较弱，固定相极性较强时称为正相谱。
2）非极性键合相
抗氧化性
硅胶表面键合烃基硅烷，所得到的即为非极性键合相。非极性键合相通常用于反相谱 （流动相的极性较强，固定相的极性较弱），即反相键合相。
3.离子交换固定相
离子交换谱法早期使用的固定相是高分子聚合物，如以苯乙烯-二乙烯苯为基体的离子交换树脂。此类物质遇溶剂易膨胀，不耐压，传质速度慢，目前已基本被离子交换键合相代替。
离子交换键合相：
以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，然后在其表面键合上各种离子交换基团，构成阳离子交换键合相和阴离子交换键合相。 利用不同离子与固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离。 主要用于各类阴、阳离子的分离、分析。
4.尺寸排阻谱法固定相
固定相（多孔性凝胶）：一种表面惰性、含有许多不同尺寸孔穴和立体网状结构的物质。 基于被测物分子尺寸和形状的不同实现分离。 组分的保留程度取决于被分离组分分子的大小，组分按照分子大小依次由大到小流出谱柱，达到分离目的。主要可用于大分子的分离。
5.亲和谱固定相
利用生物大分子与固定相之间的特异亲合力来分离生物大分子。如酶、辅酶、 激素、糖类、核酸和免疫球蛋白等的分离和纯化。
将配位体以共价键结合到基体上制成亲和谱的固定相。 当含有被分离物质（亲和物）的试样随流动 相流经固定相时，被分离物质与配位体形成复合物而被结合在固定相上，其它组分由于与配位体无亲和力而直接流出谱柱。之后， 洗脱被分离物质。
6.手性固定相
对映异构体：具有的物理性质如熔点，沸点，溶解度，折射率，密度等完全相同， 仅在分子的某个化学基团的空间构型上有差异，旋光性不同。
手性固定相法：将手性识别剂键合在固定相上，对映体与手性识别剂反应构成非对映体，利用非对映体理化性质的差异，分离、 测定。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议