高效液相谱法操作规程
目的：建立高效液相谱法的操作规程，以标准操作过程，保证检验结果准确可
靠.
适用范围：原辅料、中药饮片
责任人：质量治理部主任、检验员
内容：高效液相谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等作为流动相，用高压输液泵压入装有固定相的谱柱中，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被别离后，依次进入检测器，谱信号由记录仪、积分仪或数据工作站记录谱图. 1适用范围
高效液相谱法适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析.中国药典主要用于药品的含量测定，有关物质检查、杂质限度检查和鉴别等.
高效液相谱法主要由输出液泵系统、进样器系统、别离系统、检测系统及数据处理机〔或兼有组分收集系统〕等组成.使用时应按仪器的说明书进行操作.
3仪器的校正
3.1高效液相谱仪的柱箱控温精度、基线噪声、基线漂移、灵敏度可检测限, 线性范围的检定均按仪器说明书的技术要求进行校验，应符合规定. 3.2以紫外--可见光检测器为检测器的实验室通用液相谱仪的检定，所用各种标准物质应使用经国家技术监督部门批准颁发的标准物质.
3.3泵的耐压试验
将仪器的输液系统、进样器、谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，流量设为1ml/min，按说明书要求启动仪器，待压力平稳后保持10min，用滤纸检查各管路接头处应无湿迹.卸下谱柱，堵住泵出口端〔压力传感器以下〕，使压力到达最大允许值的90%，保持5min，应无泄漏.
3.4泵流量设定值误差〔S3〕、流量稳定性误差〔SR〕的试验.
在3.3试验条件下，按下表设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集10-25min，称重，按式⑴、⑵计算S3和SR.
S3= (Fm —F3)/F X100 (1)
SR = (Fmax - Fmin) /F X100 (2)
式中：S3——流量设定值误差,%;
Fm——〔W2-W1〕/P.t，流量的实测值,ml/min；
W2——容量瓶+流动相的重量,g；
W1——容量瓶的质量,g；
F------ 流量设定值,ml/min；
Pi——实验温度下流动相的密度,g/cm3；
T——收集流动相的时间,min；
SR——流动相稳定性误差,%；
Fmax ----- 同一组测量中流量最大值,ml/min； 晋祠流水如碧玉Fmin ------ 同一组测量中流量最小值,ml/min.
S 3和SR的校正
注：流量最高值的设定可根据实验室的要求而定.流量测量顺序可以随意选择, 但不是设定某一流量后连续测量三次，每次改变流量后至少要等5min待流量稳定后, 方可收集流动相.
4 仪器使用要求
1.1谱柱的填充剂和流动相组分应符合各品种项下规定.但因仪器型号、谱柱牌号不同，别离效果有较大差异，故除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例以及检测器灵敏度等均可作适当改变，以适应具体品种并到达系统适用性试验的要求.一般谱图约于20分钟内记录完毕.
1.2用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法对溶剂的要求.
1.3除另有规定外，柱温为室温.
1.4进样量一般为数微升，除按各品种项下规定外，也可适当改变.
1.5流动相及供试品溶液需用滤器过滤后使用或进样.流动相并先经脱气处理后使用.
1.6谱柱保存时应使填充剂处在润湿状态，两端密塞，可根据仪器说明书要求保存.如十八烷基键合硅胶可在甲醇中保存等.
5谱柱
5.1填充剂
常用谱柱填充剂，有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基键合硅胶最为常用, 辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用.如经试用不适合时，再选用其他填充剂.硅胶谱柱用于正相谱；化学键合固定相谱柱，根据键合基团的不同可用于正相谱或反相谱.如十八烷基键合硅胶、辛基键合硅胶用于反相谱或离子对谱，氰基或氨基键合硅胶可用于正相或反相谱；离子交换填充剂用于离子交换谱.凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻谱等.
5.2谱柱性能
谱柱由柱管与填充剂〔固定相〕组成.采用匀浆高压〔500-1000Kg/cm2〕装柱. 柱管多由不锈钢制成，管内壁要求有很高的光洁度.装柱前，应对整个流路进行清洗、冲淋干净、烘干、备用.填充剂选用颗粒大小均匀，以保证良好的别离效果.
分析型常量柱内径2-5mm，长10-30cm；
半微量柱内径1-1.5mm，长10-20cm；
实验室制备柱内径20-40mm，长10-30cm；
各种谱柱使用前，按说明书要求的测试条件作柱效检查，求出理论板数〔n〕及相邻组分的别离度〔R>1.5〕均应符合规定.药品检验中大多数采用柱效不很高的谱柱即可满足要求.如仪器配有较高柱效的谱柱可妥善保存，供必要时使用.另置一般柱效的谱柱作日常检验用.
6内标物的选择
6.1内标物应是样品中不含有的组分，不会使峰重叠而无法准确测量标物的峰面积.
6.2内标物的保存时间应与待测成分相近，到达完全别离，别离度三1.5.
7系统适用性试验
按各品种项下的要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应到达规定的要求；或规定分析状态下谱柱的最小理论板数，别离度和拖尾因子.
7.1谱柱的理论板数〔n〕
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录谱图，测量出供试品主要成分或内标物质峰的保存时间tR 〔以分钟或长度计，下同, 但应取相同单位〕和半顶峰宽〔亚山2〕，按n=5.54[tR/Wh/2 ]2计算谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于该品种项下的最小理论板数，应改变谱柱的某些条件〔如柱长，载体性能，谱柱充填的优劣等〕，使理论板数到达要求.
7.2别离度〔R〕
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的别离度.别离度〔口〕按式〔5〕计算：烈士褒扬条例
2〔tR2-tR1〕
R= ............................ ........... (5)
W1+W2
式中：tR2——相邻两峰中后一峰的保存时间；
tR1——相邻两峰中前一峰的保存时间；
W1+W2——此相邻两峰的宽度.
除另有规定外，别离度应大于1.5.
7.3重复性
人工呼吸机取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%，也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，参加规定量的内标溶液：配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%.
7.4拖尾因子〔T〕
谱峰的测量，除另有规定外，可根据具体情况采用峰面积法或峰高法.但用归一化法或内标法测定杂质总量时，需采用峰面积法.为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子〔T〕是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样时
的校正因子误差是否符合要求.拖尾因子〔丁〕按式〔6〕计算：
W0.05
大小头
T= (6)
2d1h
式中：W0.05h——为0.05峰高处的峰宽；
di——为峰极大至峰前沿之间的距离.
除另有规定外,T应在0.95-1.05之间.当采用峰面积法测量时，那么应检查待测峰的对称因子〔S〕是否符合要求.除另有规定外,S应在0.90〜1.10之间.
8测定方法
按各品种项下的规定，选择以下测定法中的一种进行.
8.1内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量.
a）按各品种项下的规定，精密称〔量〕取对照品和内标物质，分别配成溶液, 精密量取各溶液配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量注入仪器，记录谱图, 测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按式〔7〕计算校正因子〔f〕.
AS/CS
F = (7)
AR/C
式中：f ——校正因子；
AS——内标物质的峰面积或峰高；
AR——对照品的峰面积或峰高；
CS——参加内标物质的浓度；
CR——参加对照品的浓度.
pdlb）再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录谱图，测量供试品中待测成分〔或其杂质〕和内标物质的峰面积或峰高，按式〔8〕计算含量〔CX〕.
.一 A V
含量〔CX〕=fX -------- AX ............ (8)
AS / CS
式中：AX——供试品〔或其杂质〕的峰面积或峰高；
CX——供试品〔或其杂质〕的浓度；黎祥
f、AS、CS——的意义同式〔7〕
c）谱峰的测量，也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于规定浓度80%、100%和120%的对照品溶液.参加规定量的内标溶液，配成三份不同浓度的溶液，分别注样3次，计算平均校正因子.
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议