梁蝶霏1常瑞明2宋自姣1，3梁蔚文3刘珊英3严励1李焱1*
［摘要］目的研究钙黏蛋白6（cadherin6，CDH6）在肾脏纤维化中表达的变化。方法建立单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型，术后21天收获肾脏组织，HE染观察肾间质纤维化程度，RT⁃qPCR检测肾组织FSP⁃1、TGF⁃β1、CDH6mRNA表达量，免疫组化染检测肾组织FSP⁃1、CDH6蛋白表达量；TGF⁃β1刺激人肾小管上皮细胞HK⁃2，RT⁃qPCR及Western Blot分别检测FN1、 PAI⁃1、CDH6mRNA表达量及CDH6蛋白表达量。结果HE染显示UUO组小鼠肾脏出现肾小管萎缩、大量基质沉积，与Sham组相比，UUO组小鼠肾脏组织FSP⁃1、TGF⁃β1、CDH6mRNA表达量及FSP⁃1、CDH6蛋白表达量均上调；细胞实验结果显示，与空白对照组相比，TGF⁃β1诱导的HK⁃2细胞形态向成纤维细胞转变，FN1、PAI⁃1mRNA表达水平上调，CDH6mRNA及蛋白表达水平上调。结论TGF⁃β1诱导的肾小管上皮细胞CDH6及纤维化相关因子表达上调，伴随上皮细胞向间质表型转化，可能参与单侧输尿管梗阻诱导的小鼠肾脏纤维化的发展。
［关键词］TGF⁃β1；钙黏蛋白6；单侧输尿管梗阻；肾脏纤维化
doi：10.3969/j.issn.1009⁃976X.2018.01.003中图分类号：R692.9；R693.2文献标识码：A
Expression of cadherin6in renal fibrosis of mice with unilateral ureteral obstruction
LIANG Diefei1，CHANG Ruiming2，SONG Zijiao1，3，LIANG Weiwen3，LIU Shanying3，YAN Li1，LI Yan1
1.Department of Endocrinology；
2.Boji Medical Center；
3.Guangdong Provincial Key Laboratory of
Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen
University，Guangzhou510120，China
Corresponding author:LI Yan,liyan1964gz@163
［Abstract］Objective To investigate the expression of cadherin6（CDH6）in renal fibrosis.
Methods Mice were subjected to unilateral ureteral obstruction（UUO）and kidneys were harvested at
day21after operation.Hematoxylin and eosin（HE）staining was used for histopathologic examination.
RT⁃qPCR was used to evaluate mRNA level of FSP⁃1，TGF⁃β1and CDH6.Immunohistochemistry was
used to measure protein level of FSP⁃1and CDH6.HK⁃2human renal proximal tubule epithelial cells were stimulated with TGF⁃β1.RT⁃qPCR or Western Blot was used to evaluate mRNA of FSP⁃1，TGF⁃β1，
CDH6or protein level of CDH6respectively.Results Compared with Sham group，HE staining showed
renal tubular atrophy and deposition of extracellular matrix in UUO group.mRNA levels of FSP⁃1，TGF⁃β1，
CDH6were up⁃regulated in obstructed kidneys while compared with sham⁃operated kidneys.Furthermore，immunohistochemistry showed that FSP⁃1and CDH6were lowly expressed in sham⁃operated kidneys while
they were higher in obstructed ones.TGF⁃β1facilitated the transition of HK⁃2cells into morphology of
fibroblast⁃like cells，up⁃regulating mRNA level of FN1，PAI⁃1，CDH6and protein level of CDH6in HK⁃2
·论著与临床研究·
基金项目：国家自然科学基金（81370847）；默克雪兰诺糖尿病研究基金
作者单位：中山大学孙逸仙纪念医院1.内分泌科；2.博济医疗中心；
3.广东省恶性肿瘤表观遗传和基因调控重点实验室，广州510120
*通讯作者：李焱，Email：liyan1964gz@163
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cells.Conclusion Expression of cadherin6and fibrosis⁃related biomarkers were upregulated in HK⁃2 c
ells induced by TGF⁃β1，accompanied with phenotype transition into mesenchymal cells.This may contribute to renal fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction.
［Key words］TGF⁃β1；cadherin6；unilateral ureteral obstruction；renal fibrosis
慢性肾脏病是严重威胁人类健康的常见慢性疾病之一，目前认为糖尿病、高血压、自身免疫性疾病等均是慢性肾脏病的危险因素［1］。当炎症等刺激因素持续存在时，肾脏受到多种因子诱导发生纤维化，逐渐发展至终末期肾病［2］。肾脏纤维化的病理改变主要包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化，其特征是细胞外基质过度沉积［3］。钙黏蛋白介导细胞与细胞之间的黏附作用［4］，且与组织纤维化密切相关［5］，其中钙黏蛋白6（cadherin6，
CDH6）属于2型钙黏蛋白，在肾小管上皮细胞中表达量较高［6］，并参与肾小管上皮细胞表型的调控［7］。转化生长因子β1（transforming growth factor⁃beta1，TGF⁃β1）是肾小管间质纤维化中主要的致纤维化因子［8，9］。有文献报道，TGF⁃β1可诱导甲状腺癌细胞CDH6表达上调［10］，且CDH6与上皮细胞间质转化相关［11，12］。因此，我们推测CDH6可能在肾小管间质纤维化的进展中发挥作用。
单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruc⁃tion，UUO）小鼠模型是以进行性肾小管间质纤维化为特征的实验动物模型［13，14］。本研究中，我们通过UUO小鼠模型观察CDH6在肾脏间质纤维化中的
表达情况，再进一步用TGF⁃β1刺激人肾小管上皮细胞HK⁃2并检测CDH6的表达水平，旨在探讨CDH6在肾脏纤维化中表达的变化。
1材料与方法
1.1材料
昆明小鼠由中山大学（实验动物中心东校区）提供；人肾近曲小管细胞株（HK⁃2）由中国科学院干细胞库馈赠；胎牛血清、DMEM/F⁃12培养基均购自Gibco公司；TGF⁃β1购自Pepro Tech公司；TRI Reagent购自Sigma⁃Aldrich公司；RT⁃PCR试剂盒购自TAKARA公司；qPCR试剂盒购自Kapa Biosys⁃tems公司；RIPA购自Cell Signaling Technology公司；FSP⁃1、CDH6、β⁃actin抗体购自生工生物工程公司。
1.2方法
1.2.1动物模型8只6周龄雄性昆明小鼠平均分为2组：①假手术（Sham）组；②UUO组。术前使
用钠腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠固定于手术台上，备皮、消毒，选择右侧腹切口，Sham组仅游离右侧输尿管，UUO组游离右侧输尿管后用
4⁃0号线结扎，逐层缝合腹部切口。术后21天收获小鼠肾脏。小鼠饲养于中山大学心肺脑复苏研究所（心肺复苏病理生理实验室），给予小鼠标准饲料、自由进食及饮水。
1.2.2HE染取部分肾脏组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，60℃烤片2h，梯度乙醇脱蜡后水化，苏木素染，0.5%盐酸乙醇分化后再次水化，伊红染后50%乙醇适当分化，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。
1.2.3免疫组化染石蜡包埋肾脏组织、切片，60℃烤片2h，梯度乙醇脱蜡，水化后用0.3%过氧化氢溶液消除内源性过氧化物酶10min，置于枸橼酸钠缓冲液（pH=8.0）中微波修复抗原，山羊血清封闭10min，加入一抗（FSP⁃11∶80，CDH6 1∶100）4℃过夜，山羊抗兔二抗孵育30min，DAB 显，苏木素复染30s，自来水返蓝，60℃烘干2h，中性树脂封片，镜下观察。评分标准：随机抽取5个视野进行观察，阳性细胞率：0%~25%为0分，26%~50%为1分，51%~75%为2分，76%~100%为3分，染强度：阴性着为0分，弱染为1分，中度染为2分，强染为3分。将每个视野的阳性细胞率评分与染强度评分相乘，5个视野相加后取平均值作为最后评分。
1.2.4细胞培养及传代HK⁃2细胞在含5%胎牛血清的DMEM/F⁃12培养基中培养，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中，当细胞密度达到80%~90%时进行传代培养。取对数生长期的HK⁃2细胞以105个/孔接种于六孔板中，分为正常对照组和实验组（TGF⁃β1组），贴壁后更换为含2%胎牛血清的DMEM/F⁃12培养基培养，实验组加入TGF⁃β1（16 ng/mL）处理72h。
1.2.5HK⁃2细胞形态学观察实验组加入TGF⁃β1（16ng/mL）处理HK⁃2细胞72h，观察细胞形态变化，显微镜拍照记录。
1.2.6RT⁃qPCR按照TRI Reagent说明书提取组织及细胞总RNA，逆转录成cDNA，qPCR测定基因
表达水平，小鼠肾脏组织mRNA 以β⁃actin 作为内参基因，细胞mRNA 以GAPDH 作为内参基因，采用2⁃ΔΔCt 法分析基因相对表达量。PCR 反应条件：95℃预变性30s ，95℃变性5s ，60℃延伸30s ，共40个循环。引物序列见表1、表2。
1.2.7
Western Blot RIPA 提取总蛋白后BCA 法
定量。取40μg 细胞蛋白，SDS⁃PAGE 电泳后采用半干转装置转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h ，加入
一抗（CDH6，1∶2000）4℃过夜，山羊抗兔二抗孵育1h ，凝胶成像仪扫描拍摄蛋白条带。1.3
统计学方法
应用IBM SPSS Statistics 23.0进行统计学分
析，实验数据采用均数±标准差表示，组间比较采用t 检验，检验水准α=0.05。
2
结果
2.1
肾脏组织HE 染结果
光学显微镜下观察肾脏组织HE 染，UUO 组
可见大量肾小管萎缩，炎症细胞浸润，大量基质沉积（图1）。
2.2
肾脏组织TGF⁃β1、FSP⁃1、CDH6mRNA 表达
情况
RT⁃qPCR 结果显示，与Sham 组相比，UUO 组
肾脏组织TGF ⁃β1、成纤维细胞特异蛋白⁃1（fibroblast⁃specific protein 1，FSP⁃1）表达量明显升高，差异具有统计学差异（P <0.05）；CDH6mRNA 表达水平在两组当中虽无统计学差异，但UUO 组CDH6mRNA 表达水平较Sham 组明显升高（图2）。
表1
小鼠肾脏组织基因引物序列
sham
UUO
图1小鼠肾脏组织HE 染（×100）
注：与Sham 组比较，*
P <0.05
图2小鼠肾脏组织TGF⁃β1、FSP⁃1、CDH6mRNA 表达量
Sham
UUO
Sham
UUO
Sham
UUO
8.06.04.02.00.0
2.52.01.51.00.50.0
F S P -1相对m R N A 水平
F G F -β1相对m R N A 水平
15.010.05.00.0
C D H -6相对m R N A 水平
FSP⁃1mRNA
TGF⁃β1mRNA
CDH6mRNA
A
B
C
*
*
2.3
肾脏组织FSP⁃1、CDH6蛋白表达情况
免疫组化染结果显示，FSP⁃1蛋白主要表达
于肾小管上皮细胞的胞浆，CDH6蛋白主要表达于
肾小管上皮细胞的胞浆与胞膜，两者均呈棕染。UUO 组小鼠肾脏组织中FSP⁃1、CDH6蛋白表达量比Sham 组明显增多（图3、图4，P <0.05）。
2.4
TGF⁃β1诱导HK⁃2细胞形态改变
正常对照组HK⁃2细胞呈鹅卵石样生长，细
胞间衔接紧密；TGF⁃β1处理组HK⁃2细胞呈长梭形，细胞之间出现间隙，形态与成纤维细胞相似（图5）。2.5TGF⁃β1对HK⁃2细胞FN1、PAI⁃1mRNA 表达
的影响
RT⁃qPCR 结果显示，TGF⁃β1刺激HK⁃2细胞
72h 后，纤维连接蛋白1（fibronectin 1，FN1）、纤溶酶原激活物抑制物⁃1（plasminogen activator in⁃hibitor⁃1，PAI⁃1）mRNA 表达水平升高（图6P <0.05）。
图3小鼠肾脏组织FSP⁃1、CDH6免疫组化染（×400）
FSP⁃1
CDH6
Sham
UUO
图4小鼠肾脏阻滞FSP⁃1、CDH6免疫组化染评分*表示与sham 组比较，P <0.05
8.06.04.02.00.0
免疫组化染评分(分)
FSP⁃1
CDH6
sham
UUO
5.0
4.03.02.01.00.0
免疫组化染评分(分)
A
B
sham
UUO
*
*
图5
TGF⁃β1诱导HK⁃2细胞形态改变（×100
）
正常对照组TGF⁃β1组
图6TGF ⁃β1对HK ⁃2细胞FN 1、PAI ⁃1mRNA 表达的影响*表示与正常对照组比较，P <0.05
正常对照组
TGF⁃β1组上海杉达学院图书馆
正常对照组
TGF⁃β1组
2.52.01.51.00.50.0
F N 1相对m R N A 水平
8.06.04.02.00.0
P A I -1相对m R N A 水平
钽酸锂晶体A
B
FN1mRNA
PAI⁃1mRNA
*
*
2.6
TGF⁃β1对HK⁃2细胞CDH6mRNA 和蛋白表
达的影响
RT⁃qPCR 结果显示，与正常对照组相比，
TGF⁃β1组CDH6mRNA 表达水平升高（P <0.05）；Western Blot 结果显示，TGF⁃β1组CDH⁃6蛋白表达水平高于正常对照组（图7）。
3讨论
UUO 小鼠模型是以进行性肾小管间质纤维化
为特征的实验动物模型。小鼠肾脏在单侧输尿管完全性结扎术后7~14天即出现明显的肾积水及
肾实质丢失［13］。本研究在术后21天收获肾脏组织，通过HE 染观察病理形态，证实UUO 小鼠肾
脏组织已出现明显的肾小管间质纤维化。此外，致纤维化因子TGF⁃β1及成纤维细胞特异蛋白FSP⁃1表达量升高，进一步证实肾脏组织发生纤维
化改变。
本研究发现，与Sham 组相比，UUO 组肾脏组织中CDH6mRNA 表达水平明显升高，且CDH6蛋白主要表达于肾小管上皮细胞的胞浆与胞膜。CDH6属于2型钙黏蛋白，目前已知有多种钙黏蛋白在肾小管间质纤维化的调控中存在着重要作
用［5］。因此我们推测CDH6可能也在肾小管间质纤维化中发挥作用。
肾小管间质纤维化的改变主要包括炎性细胞浸润、成纤维细胞激活、肾小管萎缩、细胞外基质大量生成并沉积，以及微血管数量减少［3］。其中肾小管上皮细胞在间质炎症与纤维化的过程中起着关键作用［15］。TGF⁃β1是重要的致纤维化因子，一方面可诱导肾小管上皮细胞发生表型改变，另一方面可通过诱导肾小管上皮细胞凋亡或自噬从而影响细胞完整性
［16］
。本研究通过TGF⁃β1刺激
肾小管上皮细胞HK⁃2，观察到HK⁃2形态向成纤维细胞转变，纤维化指标FN1、PAI⁃1mRNA 表达水
平上调，且CDH6mRNA 与蛋白表达水平均上调。综上所述，TGF⁃β1诱导的肾小管上皮细胞CDH6及纤维化相关因子表达上调，伴随上皮细胞向间质表型转化，可能参与单侧输尿管梗阻诱导的小鼠肾脏纤维化的发展。
参
考
文
杠杆舞
献
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（收稿日期：2018⁃01⁃10）
图7TGF ⁃β1对HK ⁃2细胞CDH 6mRNA 和蛋白表达的
影响
正常对照组TGF⁃β1组
4.03.02.01.0000
C D H 6相对m R N A 水平
A
CDH6mRNA
注：与正常组对照组比较，*P <0.05Control Control TGF⁃β1TGF⁃β1
CDH6β⁃actin
B
*海德堡cp2000
豫公网安备41160202000603
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