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１ 前言
总黄酮是很多保健食品中的重要功效成份，能促进胰岛素的亲和力，在降压、降脂、降血糖方面有显著效果，同时还具有增强毛细血管通透性等作用。因此，测定其含量对于保健食品的品质和功效具有重要的意义。但目前国内还没有保健食品中总黄酮测定方法的国家标准。国内外对保健食品中总黄酮的测定，考虑到方法的简便、快捷以及平行性，多采用在碱性介质中加铝盐显的分光光度法。但是，总黄酮这种天然植物的组分非常复杂，分光光度法在实测过程中会产生各种干扰，影响结果的准确性，本方法有针对性地对此开展了研究，进行了创新并取得了较好的结果，建立了一个高效、准确的测定方法。 目前总黄酮的分析方法国外报道的有溶剂抽提法、聚酰胺薄层分析法等。但是，柱法操作复杂、时间长，难以避免实测过程中会产生各种干扰。因此比较而言，本方法立足于用常规的化学及物理检测方法，采用了超声波提取、聚酰胺吸附法经过改进系统，试验得到了快速、简易、良好的效果，在实际测定、应用中，具有更大的意义。 ２ 检测方法
csm２．１ 试剂与仪器２．１．１ 试剂与材料
ａ）无水甲醇、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、，均为分析纯，以下用水除特殊说明外，均为ＧＢ／Ｔ ６６８２－２００８中规定的三级水。
ｂ）聚酰胺粉：过８０目～１００目筛。
ｃ）５ ％亚硝酸钠溶液：称取５．００ ｇ亚硝酸钠，加水至１００ｍｌ，溶解混匀，当天配制。
分光光度法测定保健食品中总黄酮
孔鲁裔
（国家农业标准化监测与研究中心黑龙江）
ｄ）１ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：称取４．００ ｇ氢氧化钠，加水至１００ｍｌ，溶解混匀。
ｅ）１０％硝酸铝溶液：称取１０．００ ｇ硝酸铝，加
水至１００ｍｌ，溶解混匀。
ｆ）３０ ％乙醇溶液：吸取３０．０ｍｌ无水乙醇，加水至１００ｍｌ，溶解混匀。
ｇ）芦丁标准对照品：９９．５％
ｈ）芦丁标准溶液：精确称取经１０５℃干燥至恒重并按其纯度折算为１００ ％质量的芦丁标准对照品０．０１５０ ｇ，加无水甲醇溶解并定容至１００ｍｌ，此溶液浓度为１５０ μｇ／ｍｌ，０℃～４℃密封保存，保存期为两个月。
２．１．２ 仪器设备
ａ） 天平：感量０．１ ｇ和０．０００１ ｇ。ｂ）分光光度计。ｃ）超声波发生器。ｄ）恒温水浴锅。
ｅ）涡旋混合器。
ｆ）抽滤装置：真空泵、抽滤瓶、布氏漏斗、定量滤纸。
ｇ）层析柱：２０ ｃｍ以上内径为１ ｃｍ的玻璃管。ｈ）蒸发皿：规格１００ｍｌ。ｉ）具塞比管：规格１０ｍｌ和５０ｍｌ。２．２ 操作步骤２．２．１ 提取２．２．１．１ 固体样品
取有代表性样品， １ ｇ～５ ｇ（精确至０．０１ ｇ）于５０ ｍｌ具塞比管中，加入３０ ｍｌ无水乙醇，涡旋混匀３ ｍｉｎ。超声提取３０ ｍｉｎ，抽滤，用无水乙醇淋洗比管、残渣及抽滤瓶，收集全部滤液于１００ ｍｌ蒸发皿中，加１ ｇ聚酰胺粉，缓慢摇匀。于５０ ℃水浴上挥去乙醇。
摘要 研究各种操作条件对分光光度法测定保健食品中总黄酮的影响， 得到了较有价值的结论。关键词 总黄酮；保健食品；分光光度法
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２．２．１．２ 液体样品
取有代表性样品，１ ｍｌ～１０ ｍｌ（精确至０．１ ｍｌ）于５０ ｍｌ具塞比管中，加入３０ ｍｌ无水乙醇，涡旋混匀３ ｍｉｎ。超声提取３０ ｍｉｎ，抽滤，
用无水乙醇淋洗比管、残渣及抽滤瓶，收集全部滤液于１００ ｍｌ蒸发皿中，加１ ｇ聚酰胺粉，缓慢摇匀。于５０℃水浴上挥去乙醇，再调节水浴至８０℃蒸干。２．２．２ 净化
在层析柱下端填入少量脱脂棉。用７５ ｍｌ将蒸发皿中的残留物全部转入层析柱中，洗去脂肪，弃去滤液。用４０ ｍｌ无水甲醇再次冲洗蒸发皿，并转入层析柱中，控制洗脱流速小于６０ ｄ／ｍｉｎ，收集全部洗脱液于５０ ｍｌ容量瓶中，用无水甲醇定容至刻度，待测。
２．２．３ 标准工作曲线的配制及测定
分别吸取标准溶液０ ｍｌ、０．５ ｍｌ、１．０ ｍｌ、２．０ ｍｌ、３．０ ｍｌ、４．０ ｍｌ，相当于芦丁含量为０ μｇ、７５ μｇ、１５０ μｇ、３００ μｇ、４５０ μｇ、６００ μｇ，分别置于６个１０ ｍｌ刻度比管中，加入３０％乙醇溶液至 ５ ｍｌ。各加５ ％亚硝酸钠溶液０．３ ｍｌ，振摇后放置５ ｍｉｎ。加入１０％硝酸铝溶液０．３ ｍｌ，摇匀后放置６ ｍｉｎ。加１．０ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液２ ｍｌ， 用３０ ％乙醇定容至刻度，摇匀，以零管为空白，用１ ｃｍ
比皿，在５０２ｎｍ处进行吸光度测定（比测定操作须在６０ ｍｉｎ内完成），并绘制芦丁含量（μｇ）与吸光度的标准曲线。２．２．４ 样品的测定雅园玉道
根据样品中总黄酮含量，取待测液１ ｍｌ～５ ｍｌ（精确至０．１ ｍｌ）于１０ ｍｌ刻度比管中，以下按标准曲线的测定（２．２．３）操作步骤进行测定。同时另取同体积未加铝盐试剂的样液（补加０．３ ｍｌ水），作为样品基体空白，与标准工作曲线相比较定量。２．３ 结果计算
样品中总黄酮的含量（以芦丁计）按式（１）计算：
……………………（１）式中：
Ｘ —样品中总黄酮的含量（以芦丁计），单位为克每１００克或克每１００毫升（ｇ／１００ｇ或ｇ／１００ｍｌ）；
Ｃ —从标准曲线上查得的被测液中总黄酮含量，单位为微克（μｇ）；
Ｃ０—从标准曲线上查得的被测液中样品基体空白含量，单位为微克（μｇ）；
Ｖ２—样品定容体积，单位为毫升（ｍｌ）；Ｖ１—取待测液体积，单位为毫升（ｍｌ）；ｍ—称取样品质量或体积，单位为克或毫升（ｇ或ｍｌ）。
计算结果保留至小数点后两位。
３ 方法的主要技术研究过程
３．１ 测定原理
咨询业根据资料，将样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，黄酮类化合物中的３－羟基，４－羟基或５－羟
基，４－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红的络合物。用分光光度法于５０２ ｎｍ波长下测定其吸光度，与芦丁标准对照品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。３．２ 对样品中总黄酮的提取工艺的研究
总黄酮（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的总称，基本母核可认为是无苯基原酮，广泛的存在于天然植物中，组分非常复杂。一般都具有４位
羰基，大多数以苷的形式存在且呈现黄。有的具有良好的心脑血管药理活性，有的具有抗菌消炎作用，有的具有保肝作用。黄酮类化合物是用有机溶剂从植物中提取，再经纯化、干燥所得的黄粉状品，是一种天然化合物，在食品加工中是很多保健食品添加的重要功效成份。
总黄酮纯化过程中多以乙醇提取为佳。其根本原因，是由于黄酮类化合物中的游离苷元难溶或不溶于水，但易溶于乙醇，因此常用不同浓度的乙醇提取总黄酮；而黄酮类化合物中的黄酮苷类一般可溶于水也可溶于醇，因此也可用水或不同浓度的乙醇提取。而且，用水煎煮提取，亦将蛋白质、糖类等水溶性杂质一同提出，可用醇沉法、丁醇萃取法、聚酰胺柱层析法进行分离纯化，过程比较复杂；用乙醇提取，亦将树脂、蜡质、叶绿素、植物甾醇等脂溶性杂质提出，可用水沉法、碱溶酸沉法、丁醇萃取法、聚酰胺吸附层析法、交联ＰＶＰ吸附层析法等分离纯化，过程相对简单。
母亲和我们
上述是一般情况，对某一含黄酮的具体保健品而言，应根据所含黄酮的水溶性及其含量的多少，除黄酮外的其有效部分及其性质、所含蛋白质、鞣质、树脂等杂质的情况以及药材所属植物部位不同（全草、根、茎、叶）等具体情况设计出不同的
溶剂提取和不同的分离纯化工艺，经筛选试验，最终才能获得适宜的溶剂提取工艺和分离纯化工艺。３．３ 对样品中总黄酮提取条件的选择
以下选取以银杏叶、淫羊霍、黄芩为主要成分的三种有代表性的总黄酮保健食品为例，尽管以上三位药均含黄酮为主要有效成分，但由于在加工过程中使用的药用部位的不同（银杏叶使用的药用部位是叶，淫羊霍为全草、黄芩为根茎），加工过程中提取溶剂和提取工艺的不同，加工过程中分离纯化工艺的亦不同，导致在实验中得到的结果略有差异，见表１提取条件的选择。
例如，银杏叶胶囊除含黄酮有效成分外，还含有难溶于水的萜类内酯有效成分，银杏叶既含有游离黄酮也含有黄酮苷，因此，不宜用水提取，经试验，用水煎煮提取３次，黄酮的提取率仅为４５％左右；用７０％乙醇回流提取２ｈ，７５％乙醇和无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ，总黄酮提取率才可达９０％以上
所以根据试验结果，对某一含总黄酮的具体成分而言，应根据所含黄酮的水溶性及其含量的多少，除黄酮外的其有效部分及其性质、所含蛋白质、鞣质、树脂等杂质的情况以及药材所属植物部位不同（全草、根、茎、叶）等具体情况综合选取提取溶剂，经以上筛选试心得安试验
验，最终获得最适宜的溶剂提取条件为，用无水乙醇超声提取３０ｍｉｎ。
３．４ 标准对照品的选择
芦丁属黄酮类，带有明显的黄酮苷集团，是目前国际上最常用的标定总黄酮的标准对照品。由于，总黄酮（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的总称，基本母核可认为是无苯基原酮，一般都具有４位羰基，大多数以苷的形式存在且呈现黄。而其组分非常复杂，含有大量未知成分（目前还没有任何科学手段能对其全部组分进行测定）。选用芦丁作总黄酮的标准对照品，是因为芦丁不但有较优的化学稳定性，且其组份与大多数总黄酮类化合物最为接近，其在光谱扫描中的特征吸收区与总黄酮类化合物也最为接近。那么，在目前的科学手段还无法全部的测定总黄酮组分时，只能以选取一种最接近其组成的标准对照品来参照标定其含量。所以，在本标准的制定中，我们选用芦丁作为标定总黄酮的标准对照品（本标准测定的总黄酮含量以芦丁计）。
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