文章编号押2096-4730穴2020雪04-0309-07三个扬州
刺松藻中甾醇的提取、结构分析及调节血脂活性研究王燕，李小翠，王丹丽，徐萍，赵玉勤，陈荫 (浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山316022)
摘要：采用乙醇回流和皂化的方法提取刺松藻中的甾醇，并以磷硫铁作为显剂，利用分光光度法对其进行定量分析。并采用正交试验设计，考察料液比、提取温度、提取时间以及乙醇浓度对回流提取结果的影响。采用红外光谱对甾醇提取物进行定性分析，并通过GC-MS确定甾醇的结构。为探讨刺松藻甾醇的调节血脂功效，建立高脂高糖小鼠模型，选定不同剂量的甾醇提取物灌胃小鼠。研究表明，刺松藻中甾醇回流提取的最佳条件为：乙醇浓度95%、料液比1:20、提取时间4h、提取温度90℃，甾醇含量为2mg·g-1。GC-MS分析表明主要刺松藻中主要含有胆甾醇,24-乙基-胆甾-5,23-二烯-3β-醇和24-甲基-胆甾-5-烯-3β-醇乙酸酯。刺松藻甾醇尤其中高剂量条件下能有效降低高脂模型中小鼠的体重、肝重及肝系数，对小鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平有改善作用，降低动脉硬化指数(AI)。综上表明，刺松藻甾醇具有调节血脂的作用。 关键词：刺松藻；甾醇；提取工艺；正交试验；高脂血症
中图分类号：TS201.1文献标识码：A
Extraction,Structural Analysis and Regulation of Blood Lipid
Activity of Sterols from Codium fragile
WANG Yan,LI Xiao-Cui,WANG Dan-Li,et al
(School of Food Science and Pharmaceutics of Zhejiang Ocean University,Zhoushan316022,China)
Abstract:In this study,to research and utilize the sterol in Codium fragile,the extraction technology of sterol was confirmed by ethanol reflux and saponification.The spectrophotometric method was developed to de-termine the content of sterol using phosphorus sulfur iron solvent as chromogenic reagent.The orthogonal test was used to study the influence of ethanol concentration,solid liquid ratio,extraction time and temperature to the yields of sterol.IR and GC-MS was used to analyze the structures of the sterol.To investigate the allevia-tive effects of phytosterol from C.fragile on lipid metabolism,the hyperlipidemia model mice were established by feeding a high fat and sugar diet,and different doses of sterol extracts were given to mice by gavages.The optimum extraction process was determined as follows:ethanol concentration was95%,liquid-solid was1:10, extraction time was4h,and extraction temperature was90℃.Three sterols were identified by IR and GC-
收稿日期:2019-08-02
基金项目：国家自然科学基金(81673349);2019年浙江省公益技术应用社会发展项目(LGF19D060004);2018年国家级大学生创新创业训练计划项目(20180340017);2018年浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划)(2018R411048)作者简介：王燕(1997-)，女，浙江桐乡人，研究方向：海洋药物.
通信作者：陈荫(1984-)，男，湖北随州人，博士，副教授.E-mail:******************
310
浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第39卷MS.They were cholesterol,24-ethyl-cholesta-5,23-dien-3β-ol and24-methyl-cholesta-5-en-3β-ol ac-etate.In the animal experiment,compared with the hyperlipidemia model group,the results showed that espe-cially medium and high dose groups could significantly decrease the contents of weight,liver weight,liver co-efficient and AI,improve TC,TG,LDL-C levels and HDL-C levels.In conclusion,phytosterol from codium fragile can reduce blood lipids in mice especially at high doses.
Key words:Codium fragile;sterol;extraction technology;orthogonal test;hyperlipidemia
植物甾醇(phytosterols,plant sterol)是一类广泛存在于植物体的天然生理活性物质，其结构与胆固醇相似，是含3位羟基的甾体化合物，具有免疫调节、消炎退热、抗肿瘤、降低血脂和胆固醇及护养皮肤等多种生理功效[1-5]，和动物中胆固醇起相同的作用[6]。POLLAK O J,et al[7]以谷甾醇为药物，证实了植物甾醇对高胆固醇患者存在一定功效。近年来，植物甾醇以明确的降血脂作用和安全性，引起了人们极大的关注[8-9]。但以上研究应用的植物甾醇以陆源植物甾醇居多,CHEN Zhen,et al[10]对源于海洋的植物甾醇研究中，发现中药海藻的总甾醇具有很好的降血脂作用。随着植物甾醇应用范围的不断扩大，其制备技术也在不断提高，选择和开发简单有效的生产工艺，是取得较好效益的关键[11]。
刺松藻Codium fragile是一种广泛分布于温带海域的大型海藻，常见于我国黄海和渤海，属于绿藻门、绿藻纲、管藻目、松藻科、松藻属。生长于低中潮带的岩石上[12]。作为一种高膳食纤维、高蛋白、低脂肪、低热量，且富含铁、锌等微量矿物质元素的天然理想保健食品原料[13]，其脂溶性成分主要为烷烃、不饱和脂肪酸、甾醇类成分，具有很好的药用前景[14]，可用于海洋功能性食品、药品等的开发，以增加其附加值，但目前国内外对该藻的研究大多集中在其多糖等大分子活性物质，而对于低极性的植物甾醇等小分子化合物则相对较少，对于其提取分离更未进行深入研究[15-17]。本文通过对刺松藻内甾醇的提取及分析，探究甾醇对血脂的作用和影响，以期为深入开发海洋生物资源，为植物甾醇提取提供新的途径与理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料与仪器
刺松藻(采自南麂岛)；健康SPF小鼠25只(雌雄各半,28g左右)；高脂高糖饲料(配方为基础饲料55.8%、猪油18%、蛋白质25%、胆固醇1%、牛胆盐0.2%)。
总胆固醇(total cholesterol,TC，南京建成生物工程研究所)；甘油三酯(Triglyceride,TG，南京建成生物工程研究所)；低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C，上海酶联生物科技有限公司)；高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C，上海酶联生物科技有限公司)；磷硫铁显剂(实验室自配)[12]；乙醇(分析纯)；氢氧化钾(分析纯)；正己烷(分析纯)；石油醚(分析纯);85%浓磷酸；无水硫酸钠；三氯化铁(FeCl3·6H2O)。
三叔丁基膦BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；数显恒温水浴锅(金坛市亿能实验仪器厂); A-1000S水流抽气泵(上海爱朗仪器有限公司);N-1100旋转蒸发仪(海爱朗仪器有限公司)上;TGL-16G 高速离心机(上海安亭科学仪器厂);UV-1800PC型紫外可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司); Thermo Fisher酶标仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。
1.2试验方法
1.2.1刺松藻甾醇的提取
将刺松藻用90%乙醇按料液比1:20在80℃下回流提取4h[18-19]，真空抽滤后滤液在35℃下减压蒸干，用10mL10%KOH-乙醇溶液将其提取物溶出，加入到具塞试管中,65℃下皂化3h，皂化物离心取上清液，然后加入10mL正己烷和15mL水进行萃取[15]，分层后取上层有机相，水相用正己烷反复萃取至有机相无，合并正己烷相，用30%乙醇溶液洗涤至乙醇相无且呈中性，取出正己烷相经无水Na2SO4脱水10min，再加入少量活性炭粉末，于60℃下水浴搅拌脱20min[20]，抽滤得滤液在35℃下减压蒸干得刺松藻甾醇提取物，用高浓度乙醇将其溶出得刺松藻甾醇样品溶液。
第4期1.2.2刺松藻甾醇的含量测定精密称取谷甾醇标准品，用甲醇溶解并定容配制成1.013g ·L -1的谷甾醇贮备液，再从中精密量取5mL 至25mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线，摇匀即得0.2026g ·L -1谷甾醇对照品溶液[19]。
精密量取谷甾醇对照品溶液0.2mL ，置于干燥具塞试管中，水浴蒸干后，精密加入2mL 无水乙醇，涡旋混匀，再沿管壁精密加入磷硫铁显剂2mL ，在室温下立即摇匀稳定10min ，以无水乙醇作为空白参比，使用紫外分光光度计在400~800nm 范围内进行扫描，选取最大吸收波长作为检测波长。
依次精密量取谷甾醇对照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40mL ，按照上述的操作，在530nm 处测定溶液的吸光度。每个点重复3次，以谷甾醇浓度(X )为横坐标，吸光度(Y )为纵坐标，绘制标准曲线。
将刺松藻甾醇样品溶液水浴蒸干后，精密加入2mL 无水乙醇，涡旋混匀，再沿管壁精密加入磷硫铁显剂2mL ，在室温下立即摇匀稳定10min ，以无水乙醇作为空白参比，在530nm 处测定溶液的吸光度。样品总甾醇含量按下式计算:
样品总甾醇含量(mg ·g -1)=
W *V *t m 其中:W 为吸光度对应的样品中甾醇的浓度(mg ·mL -1);V 为定容体积(mL );t 为稀释的倍数;m 为样品总重量(g )。1.2.3刺松藻甾醇回流提取工艺的正交试验在单因素试验的基础上，对乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度进行4因素3水平正交试验设计,
以得到甾醇的最佳提取工艺，试验方案见表1。表1正交试验设计因素水平表
Tab.1Factors and levels of orthogonal test on extraction condition of sterol from apple seed oil 水平
因素A 料液比/(g ·mL -1)B 提取时间/h C 提取温度/℃D 乙醇浓度/%1231:101:201:302468085907585951.2.4刺松藻甾醇的红外光谱分析采用KBr 压片法，首先将KBr 粉末在真空中干燥至恒重后，在研钵中研磨至粉末，再用压片机压制成透明薄片。样品溶在正己烷中，配制成5mg ·mL -1的溶液，均匀的涂在KBr 薄片上，待溶剂挥发干后进行红
外扫描，其扫描范围为4000~400cm -1，背景扫描次数32次，分辨率为4.0cm -1。
1.2.5刺松藻甾醇的GC-MS 分析为确定刺松藻甾醇的主要成分，对混合物进行GC-MS 分析。其中GC 条件：采用DB-5ms 气相谱柱(0.25mm ×30m)，进样口温度250℃，载气为氦气，柱流速0.8mL ·min -1，起始温度150℃，保持3.5min ，以20℃·min -1升至200℃，保持5min ，再以5℃·min -1升至280℃，保持30min 。MS 条件:EI 源，电子能量70eV ，离子源温度200℃，接口温度250℃,SCAN 模式，质量扫描范围为50~500.根据GC-MS 总离子流谱图中各组分的质谱，确定分子量，再通过NIST 标准谱库并参考甾醇标准和参考文献进行鉴定后，采用面积归一发计算各甾醇的百分组成[21]。1.2.6动物水平调节血脂作用研究模型建立:30只受试小鼠适应性喂养基础饲料7d ,1周以后尾部采血，测定空腹血清总胆固醇(TC )，按TC 水平和体重分为空白对照组、模型组、3个剂量组[22]，共5组。对照组给予基础饲料，其他组给予高脂高糖饲料。对照组和模型组小鼠灌胃0.5mL 的拉油，各剂量组给予分别灌胃含有低、中、高剂量的刺松藻甾醇提取物，每天灌胃0.5mL ，植物甾醇3种剂量以拉油作溶剂配制，连续45d ，造模期间，自由饮水、摄食[23]。每周称体重1次，隔日准确记录进食量。
血清的制备：最后一次给药后禁食不禁水5h ，各组小鼠眼眶取血，放入1.5mL 离心管中,4℃下保王燕等：刺松藻中甾醇的提取、结构分析及调节血脂活性研究311
浙江海洋大学学报穴自然科学版雪第39卷
表2正交实验结果分析表
Tab.2Results and range analysis of orthogonal test
项目A B C D甾醇得率/%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 R
1
1
1
2
2
2
3
3
3
0.121
0.155
0.116
0.039
右旋氨基物1
2
3
1
2
3
1
陈露教你学滑冰
2
3
0.090
0.151
0.152
0.062
1
2
3
2
3
1
3
1
2
0.129
0.107
0.157
0.050
1
2
3
3
1
2
2
3
1
0.107
0.091
0.195
0.104
0.055
0.077
0.232
0.154
0.177
0.135
0.061
0.198
0.090
存，并及时以2500r·min-1离心10min，离心后取血清以备测定用。
指标测定:(1)血清脂质的测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDL-C)均根据试剂盒要求采用酶法进行检测。
(2)肝脏系数的测定将处死的小鼠分离肝脏，滤纸吸干后称其重量(g)，按下式计算肝脏系数；肝脏系数(%)=肝脏重量(g)/体重(g)×100
(3)动脉硬化指数的测定动脉硬化指数(AI)=(TC-HDL-C)/HDL-C
数据处理：实验数据采用SPSS软件，经统计分析后以平均值±标准差(x±s)表示，组间差经t检验。2结果与分析
2.1刺松藻甾醇含量测定
最终谷甾醇标准品溶液的最大吸收波长在530nm，吸收峰较为平缓，故选择530nm作为检测波长(图1)。制作谷甾醇标准曲线，结果见图2，标准曲线的回归方程为y=8.3935x-0.0339,R2=0.9994。
谷甾醇浓度/(mg·mL-1)
图1谷甾醇标准品紫外全波长扫描图Fig.1Sitosterol standard UV wavelength scanning chart
图2谷甾醇标准曲线Fig.2Standard curve of sitosterol
y=8.3935x-0.0339
R2=0.9994
波长/nm
对刺松藻甾醇样品溶液进行测定，采用2.1的标准曲线计算甾醇含量，根据公式得到样品中甾醇含量为2.06mg·g-1。
2.2刺松藻中甾醇回流提取的最佳条件确定
由表2可知，根据极差R值大小可以看出影响刺松藻甾醇回流提取的因素顺序为乙醇浓度>提取时间>提取温度>料液比，其中乙醇浓度对甾醇的提取率影响最大。比较各因素的K值可以得出最佳因素组合为A2B2C3D3，即回流提取刺松藻中甾醇的最佳条件为料液比1:20，提取时间4h，提取温度90℃，乙醇浓度95%。
312
第4期表4刺松藻植物甾醇对小鼠血脂水平的影响（x ±s ，n =5）Tab.4
Effects of phytosterol on the serum lipid levels in mice 2.3刺松藻甾醇的红外光谱分析通过红外光谱对混合物的结构特征进行分析(图3所示),3350cm -1是羟基的伸缩振动,2950,2933和2892cm -1处强的吸
收峰是饱和CH 的伸缩振动,1700cm -1左右是C=C 双键的伸缩振动,1460和1382cm -1是饱和CH 的变角振动,1040cm -1左右是C-O 的伸缩振动。综合分析并参照参考文献表明，该混合物符合甾醇的基本光谱特征[24]。2.4刺松藻甾醇的GC-MS 分析对刺松藻中甾醇进行GC-MS 进行分离和鉴定，所得各峰的质谱经计算机检索和数据库比对鉴定出各个甾醇的结构(表3和图4)。结果表明刺松藻中甾醇的种类较少，主要含有胆甾醇,24-乙基-胆甾-5,23-二烯-3β-醇和24-甲基-胆甾-5-烯-3β-醇乙酸酯[25]，比例约为1:3:8。
图3
刺松藻甾醇的红外光谱图Fig.3IR spectrum of sterols from C.fragile 1.胆甾醇;2.24-乙基-胆甾-5,23-二烯-3β-醇;3.24-甲基-胆甾-5-烯-3β-醇乙酸酯图4刺松藻中所含甾醇
mis系统Fig.4Sterols in the alga C.fragile
2.5刺松藻甾醇对小鼠血脂水平的影响由表4可见，实验45d 后，对照组和高脂模型组的血清TC 之间存在显著性差异(P <0.05)，对照组的血清TC 明显低于高脂模型组。实验组较高脂模型组的血清TC 低，但实验组之间无显著性差异。说明刺松藻植物甾醇对小鼠血清TC 有降低作用，但无明显效果。
表3各甾醇的m /z 及百分含量Tab.3m /z and percents of all kinds of sterols 化合物
m /z 含量(100%)123386,371,368,353,329,301,275,255,213
458,398,383,365,333,287,271,253412,397,369,351,327,314,300.281,271,229,213
8.32566.7组别
总胆固醇TC/(mmol ·L -1)甘油三酯TG/(mmol ·L -1)低密度脂蛋白LDL-C/(mmol ·L -1)高密度脂蛋白HDL-C/(mmol ·L -1)对照组
高脂模型组
3.86±0.455.97±0.77*0.79±0.061.10±0.15* 6.41±0.456.39±0.39 1.02±0.050.97±0.02*5.56±0.945.61±0.775.57±0.450.68±0.26*0.59±0.09*0.42±0.03* 6.53±0.95
5.90±0.45
5.20±0.75*0.96±0.040.99±0.120.99±0.04实验组低剂量
中国麻风皮肤病杂志中剂量
高剂量对照组和高脂模型组的血清TG 之间存在显著性差异(P <0.05)，对照组的血清TC 明显低于高脂
模型组。实验组均与高脂模型组的血清TG 之间存在显著性差异(P <0.05)，且低于对照组血清TG ，说明刺松藻植物甾醇能显著降低小鼠血清TG 。实验组中低剂量组和中剂量组降低血清TG 效果差异不明显，但高剂量组与其他两组实验组降低血清TG 效果差异显著(P <0.05)。注:*表示与对照组差异显著(P <0.05);**表示与高脂模型组差异显著(P <0.05)，下同.
王燕等：刺松藻中甾醇的提取、结构分析及调节血脂活性研究波数/cm -1
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