《中国产前诊断杂志（电子版）》 ２
０１７年第９卷第３期·综述·
招丽坚１ 王晨虹２
（１．广西壮族自治区人民医院产科，广西南宁５３００２１；２．南方医科大学深圳医院产科，广东深圳５１８１１０
）【摘要】 发现母体外周血游离胎儿ＤＮＡ已２０年，无创产前诊断领域取得了重大突破，改变了现有的产前筛查模式。无创产前诊断单基因病已得到越来越多的关注及研究。一些单基因遗传病的无创产前诊断已经应用于临床实践， 其他常见单基因遗传病无创产前诊断也得到了发展。本文针对目前无创性产前诊断常见单基因病的思路、研究现状及进展进行综述。
【关键词】 游离胎儿ＤＮＡ；无创产前诊断；单基因病；二代测序；相对突变剂量；相对单倍体剂量【中图分类号】 Ｒ７１４．５５ 【文献标识码】 Ａ 犱狅犻：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐ
ｄ．２０１７．０３．００６ 通讯作者：王晨虹，Ｅ ｍａｉｌ：ｓｚｗａｎｇｃｈｅｎｈｏｎｇ＠ｖｉｐ
．１６３．ｃｏｍ 自１
９９７年发现胎儿游离ＤＮＡ（ｃｅｌｌｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡ，
ｃｆｆＤＮＡ）以来［１］
，无创产前筛查胎儿非整倍体迅速成为学术界的热点，
已取得了令人瞩目的进展，改变了传统的产前血清学筛查模式［２］
。分子计
数技术如二代测序（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，
ＮＧＳ）［３］及数字ＰＣＲ技术（ｄｉｇ
ｉｔａｌＰＣＲ，ｄＰＣＲ）［４
］的发展，促进了无创产前诊断领域取得了突破性的进展。科学家们利用ｃｆｆＤＮＡ对单基因病产前诊断进行的探索成绩显著，
使更多的单基因病无创产前诊断（ｎｏｎ ｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ＮＩＰＤ）方法逐渐接近临床实践要求。１ 单基因病犖犐犘犇概述
单基因遗传病（ｓｉｎｇｌｅｇｅｎｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ），简称单基因病，是指一对等位基因或一对同源染体上单个基因发生变异产生的遗传病。突变基因在常染体上或性染体上可呈显性或隐性遗传方式。单基因遗传病经典的遗传方式符合孟德尔定律。全世界已知的单基因遗传病有７０００多种，总体人发病率约１％， 单基因疾病十分困难，产前诊断高危胎儿遗传状态具有极其重要的意义［５］
。一些学者认为［６］，某些单基因疾病高危妊娠的无创产前检测具 有诊断性质，
可以看作是侵入性检测的替代方案，这种观点认为与非侵入性产前检测（ＮＩＰＴ）非整倍体原理不同，ＮＩＰＴ可能因胎盘嵌合体或母体染体异常而出现假阴性或假阳性结果，而无创产前诊断单基因疾病不存在上述因素，因为有明确家族史或超声改变，针对特定致病基因进行检测，所以具有诊断
性质。
２ 无创性产前诊断单基因病的思路及研究进展２．１ 存在／不存在策略 单基因疾病种类众多，单基因病的无创产前诊断较为复杂，每一种疾病都有各自无创产前诊断技术的挑战。在妊娠状态下母体血浆中检测到非孕期不存在于母亲基因组的等位基因可以确定在这些等位基因起源于胎儿或可能与胎儿基因组有关，而某些特异性等位基因缺失表示胎儿为非父系遗传等位基因携带者。基于这种存在／不存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ／ａｂｓｅｎｃｅ）的标准，已成功应用于父系遗传常染体显性遗传病、新发突变（犱犲狀狅狏狅ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）和双亲携带不同突变类型常染体隐性遗传病父系遗传等位基因排除性诊断上。
２．１．１ 应用于常染体显性遗传病单基因疾病 无创产前诊断最初的研究是从常染体显性遗传病和新发突变开始。软骨发育不全（ａｃｈｏｎｄｒｏｐ
ｌａｓｉａ）是第一个进入临床实践的单基因遗传病之一［７］
，是
以肢体短小为特征的常染体显性遗传性疾病，
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９８％的致病基因位于４号染体短臂犉犌犉犚３基因上的ｃ．１１３８Ｇ＞Ａ突变［８］，部分为新发突变，与父亲高龄所致精子缺陷有关。最早的基于母血胎儿游离ＤＮＡ无创产前诊断软骨发育不全的文献由日本学者ＳａｉｔｏＨ于２０００年报道［９］。作者采用限制性片段长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙ ｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）ＰＣＲ方法，在１例有软骨发育不全高风险孕妇的外周血浆里检测到犉犌犉犚３基因ｃ．１１３８Ｇ＞Ａ突变，而该突变不存在于孕妇的白细胞ＤＮＡ中，推导突变来自胎儿的父亲。羊水细胞直接测序证实存在该突变，婴儿出生后的Ｘ线检查显示四肢有轻微的缩短，无创检测结果与出生后诊断一致。随着分子计数技术的发展，检测方法可以更简便和准确，这种检测策略一直应用于父系遗传常染体显性遗传性疾病的无创产前诊断，除了软骨发育不全，这一策略还在其他常染体显性遗传病如强直性肌营养不良（ｍｙｏｔｏｎｉｃｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）［１０］、致死性侏儒（ｔｈａｎａｔｏｐｈｏｒｉｃｄｙｓｐｌａｓｉａ）［１１］、亨廷顿病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎｄｉｓｅａｓｅ）［１２］验证实验均取得成功。目前在英国等国家，基于母血ｃｆｆＤＮＡ无创产前诊断软骨发育不全和致死性侏儒已在临床应用［１１］。２．１．２应用于常染体隐性遗传病 存在／不存在策略也被用于无创产前诊断常染体隐性遗传病，当父母携带不同的突变时，用于确定胎儿父系突变遗传状态，当
检测到父系野生型等位基因或未检测到父系突变型等位基因，将表明胎儿不存在严重疾病的风险，可以避免需要侵入性诊断程序，减少５０％有创产前诊断的几率。先天性肾上腺皮质增生（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｄｒｅｎａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ＣＡＨ）［１３，１４］是由于６号染体上编码２１羟化酶的犆犢犘２１基因突变导致皮质激素合异常，造成突变纯合子女性胎儿外生殖器男性化。若妊娠第９周生殖器官发育前就开始使用地塞米松则能够预防生殖器官两性化。传统的绒毛穿刺术最早于孕１１周进行，而ＮＩＰＤ最早可于６周诊断［１５］，早期确定受累胎儿可以避免正常胎儿接受不必要的药物，减少用药的副作用。ＣＡＨ是无创产前诊断最有临床意义的疾病之一。２００２年，Ｃｈｉｕ等人［１６］通过一例生育过一个ＣＡＨ复合杂合子患儿的再次妊娠的夫妇作为疾病模型，首
次提出基于孕妇血浆ｃｆｆＤＮＡ无创性产前诊断常染
体隐性遗传病父系等位基因遗传状态的策略。在
研究中该孕妇血浆中检测到父系野生型等位基因，
过日子要有技术含量则推断胎儿没有遗传到父亲突变等位基因，胎儿不
江苏省物业管理条例会是ＣＡＨ受累儿，不需要产前干预。
囊性纤维化（ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＣＦ）［１７］是白人中最
常见的致寿命缩短的遗传性疾病，白人中基因携带
者占３％。ＣＦ是常染体隐性遗传病，由位于７号
染体长臂编码膜相关蛋白的ＤＮＡ突变引起，导
致外分泌腺功能紊乱，主要影响胃肠道和呼吸系统。２００８年，ＢｕｓｔａｍａｎｔｅＡ等人［１８］采用单碱基延伸测序（ＳＮａＰｓｈｏｔ）的方法，在３例ＣＦ高风险孕妇血浆
中有２例检测父系突变，排除１例侵入性产前诊断
的需要。
β 地中海贫血简称β地贫，是一组以β 珠蛋白链合成减少或缺乏的遗传性血液疾病，导致血红细
胞血红蛋白生产减少，红细胞生成减少和贫血［１９］。
β地贫是无创产前诊断研究最多的单基因遗传病之一，其分子基础是位于１１号染体短臂１区５带５天文学报
亚带（１１ｐ１５．５）位点上的Ｂ珠蛋白（ＨＢＢ）缺陷所
致。在中国南方地区有４类突变最为常见，包括ＣＤ４１ ４２（ ＴＣＴＴ）、ＩＶＳ ２ ６５４（Ｃ Ｔ）、Ｔ ２８（Ａ Ｇ）和ＣＤ１７（Ａ Ｔ），占突变类型的６５％［２０］。２００２年，Ｃｈｉｕ等人［１６］对８对携带不同β地贫基因突变的夫妻进行无创产前检测。通过特异性等位基因引物（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ）和荧光探针及实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ）检测，其中８个胎儿中，６个发现父亲突变，排除２例重型β地贫胎儿，避免了不必要的产前诊断。对剩下的６例进行侵入性产前诊断发现４个β地贫基因突变复合杂合子，２例没有遗传到母亲突变基因，为β地贫突变携带者。２０１５年ＣｈｅｎＪＪ等［２１］对８对携带相同β地贫突变的夫妇进行无创产前诊断，利用连锁单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳＮＰ）确定胎儿是否继承父系野生型或突变型等位基因，其基本原则也是通过母血中与父系野生型等位基因连锁的ＳＮＰ存在与否来预测胎儿的基因型，判断胎儿是否为重型地贫儿，排除有创性产前诊断的需要。３例母血中检测到父系突变型等位基因连锁的ＳＮＰ，这些孕妇仍
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需要传统侵入性产前诊断判断胎儿是否遗传母亲突变导致重型地贫儿。
然而基于存在／不存在原则的方法只能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，而无法进一步确定胎儿是否继承了母源突变。这是目前单基因遗传病无创产前诊断的难点，如何进一步明确胎儿是否继承了母源性突变基因是单基因病无创产前诊断技术达到临床应用的基本要求。
２ 相对变异量／相对单倍体剂量分析
Ｘ连锁遗传病和父母携带有相同突变的常染体隐性遗传病被认为是单基因遗传病无创产前诊断中最有技术难度的疾病类型，因为需要母体同源ＤＮＡ高背景下，分析从母体遗传来的胎儿等位基因。为了区分胎儿母系遗传等位基因与强大的母体背景基因，需要更灵敏、更准确的检测技术和策略。２．１ 相对变异量分析 ２００８年，Ｌｏ［２２］团队基于ｄＰＣＲ技术平台建立了相对变异量（ｒｅｌａｔｉｖｅｍｕｔａ ｔｉｏｎｄｏｓａｇｅ，ＲＭＤ）理论，该方法通过统计学的序贯概率比试验（ＳＰＲＴ）判断母源性的突变等位基因和野生型等位基因是否平衡存在于母体血浆ＤＮＡ中。在杂合子非孕妇血浆中突变型和野生型等位基因平衡比例为１∶１，而在妊娠期间，胎儿ＤＮＡ释放到母体循环会改变母体相对等位基因１∶１的平衡状态，偏移幅度取决于胎儿ＤＮＡ含量。当胎儿从父亲遗传了野生型等位基因又从母亲遗传了突变型等位基因，即母儿均为突变型杂合子时，母体血浆ＤＮＡ中野生型等位基因和突变型等位基因保持平衡；当胎儿为突变纯合子或野生纯合子时，母体血浆
硫酸锌片ＤＮＡ中野生型等位基因和突变型等位基因出现不平衡，表现为突变型等位基因的含量大于或小于野生型等位基因。这种方法可以针对Ｘ连锁隐性遗传病或夫妻携带相同常染体隐性遗传病时推导胎儿继承了母亲的哪一个等位基因。
血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）是一组典型的Ｘ连锁隐性遗传性出血性疾病，患者几乎全为男性，女性多为致病基因携带者。临床上分为Ａ、Ｂ二型，分别为凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）和Ⅸ（ＦⅨ）缺乏所致，ＦⅧ和ＦⅨ基因分别位于Ｘｑ２８和Ｘｑ２７上［２３］。Ｔｓｕｉ等［２４］应用ｄＰＣＲ检测来自７例怀男胎的血友病基因携带者孕妇的１２例血浆样本，选取Ｘ染体上一个杂合子ＳＮＰ进行ＲＭＤ分析，在１２个样本均中成功检测出胎儿携带状态。
ＲＭＤ的方法也应用于检测常染体隐性遗传病母系遗传突变。除了应用于β地中海贫血［２２］，还有镰状细胞性贫血［２５］和甲基丙二酸血症［２６］等。２．２ 相对单倍体剂量分析 单倍体（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）是单倍体基因型的简称，在遗传学上是指在同一染体上共同进行遗传的多个基因座上等位基因的组合。通俗的说法就是若干个决定同一性状的紧密连锁的基因构成的基因型。相对单倍型剂量分析（ｒｅｌａｔｉｖｅｈａｐｌｏｔｙｐｅｄｏｓａｇｅ，ＲＨＤＯ）是２０１０年Ｌｏ等［２７］利用ＮＧＳ平台建立对母体血浆ＤＮＡ进行全基因组测序，通过同一染体上相邻的ＳＮＰ位点建构单倍体进行定量比较分析的方法，目的在于通过ＳＰＲＴ判断母体血浆中是否存在单倍型相对剂量不平衡现象。ＲＨＤＯ分析的几个步骤包括确定信息ＳＮＰ和建构母系遗传单倍体，
最后推导胎儿基因型。信息ＳＮＰ指相同等位基因座位上父母一方为纯合子而另一方为杂合子的ＳＮＰ。ＲＨＤＯ分析进行单基因常染体隐性遗传病ＮＩＰＤ多数情况下应用于有先症者或纯合子儿童的家庭。首先，通过纯合子儿童和父母ＤＮＡ样本分析，可以确定致病突变基因的同时也确定与致病基因连锁的信息ＳＮＰ，用于推导与突变或正常等位基因连锁的亲本单倍体。在双亲为常染体隐性遗传病杂合子状态下，父系遗传状态通过检测母体血浆中非母源性的父系遗传信息ＳＮＰ和／或突变推导。其次，母系遗传状态是通过分别检测与突变型／野生型等位基因连锁的信息ＳＮＰ，并比较两种信息ＳＮＰ比例失衡的情况推导胎传母系遗传单倍体。
靶向捕获测序（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）是指针对感兴趣的目标区域或基因（完整的编码区域全外显子）测序，通过靶区域捕获和扩增的方法富集，然后进行大规模测序，有助于降低大规模筛查特定疾病已知致病位点的成本，在临床诊断方面有着巨大的应用潜力。与全基因组深度测序相比，有针对性地对候选基因组区段或靶向基因进行深度测序不仅可
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以降低测序成本，还可以提高测序的效率。使用靶向测序结合ＲＨＤＯ分析是单基因疾病无创产前诊断的通用方法。ＮｅｗＭＩ等人［２８］采用靶向测序结合ＲＨＤＯ方法成功地在早期检测了１４例ＣＡＨ高危妊娠的胎儿状况。该方法捕获了犆犢犘２１犃２基因侧翼６ Ｍｂ区域，利用每个家系的父母和先证者基因组信息ＳＮＰ构建了父母的单倍型，在母体血浆ＤＮＡ推导出胎儿从父母遗传到的基因型，这样在最早妊娠５＋６周时可以正确预测所有家系的胎儿ＣＡＨ状况。除了ＣＡＨ，这种靶向单倍体分析方法已经成功应用在杜氏和贝氏肌营养不良症［２９，３０］、Ⅰ型戈谢病突变［３１］、先天性耳聋［３２］等无创产前诊断。２．３ ＲＭＤ／ＲＨＤＯ区别 当评估胎儿母系遗传突变时，ＲＭＤ或ＲＨＤＯ分析提供了一个有力的工具。ＲＨＤＯ是基于ＮＧＳ的单倍型相对剂量分析，而ＲＭＤ是基于ｄＰＣＲ单个突变位点平衡状态的比较。ＲＨＤＯ概念与ＲＭＤ相似，但不同的是，ＲＨＤＯ不依赖于特异性突变检测，避免了针对特异性突变的设计检测，而检测并定量信息ＳＮＰ是ＲＨＤＯ的关键步骤。与仅通过一个特定的基因突变或ＳＮＰ来测量等位基因比例的ＲＭＤ不同，ＲＨＤＯ检测母体单倍型的平衡与否，它使用更多的测序序列（ｒｅａｄ），而不是仅仅分析直接围绕突变位点的ｒｅａｄ，通过对一个单倍型多个ＳＮＰ位点的测试，增加了检测的稳定性，因而ＲＨＤＯ更敏感，检测结果更可靠。而ＮＧＳ具有高通量、高数据量产出、高效率及低成本等优点已使ＮＧＳ成为一项常规技术应用于无创性产前诊断领域。ＮＧＳ联合强大的ＲＨＤＯ分析可以检测更多的单基因病。
３ 无创产前诊断单基因病的挑战
ＮＧＳ和ｄＰＣＲ的出现，结合ＲＭＤ和ＲＨＤＯ，使单基因病无创产前诊断取得更进一步的发展。但无创产前诊断单基因病在临床实践应用仍然面临着巨大挑战。
３．１ 针对不同的单基因病需要制定检测实验 检测父系常染体显性遗传病或新发突变相对简单直接，也最早应用于临床实践。对于常染体隐性遗传病或Ｘ连锁遗传病，需要构建父母的单倍型是限
制无创产前诊断单基因病发展的一个主要原因。目前已开发出各种分子技术用于解决构建父母单倍体的问题［３３］，但这些分子技术成本昂贵且费时费力不适用于临床实践。
３．２ 定位罕见单基因病致病位点困难 特殊情况下需要进行家系分析，有些单基因疾病致病基因种类繁多，突变基因跨越区域长，需要通过纯合子或复合杂合子先症者确定突变基因。例如Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）是最常见的进行性肌营养不良症，是一种严重致死性Ｘ连锁隐性遗传病，ＤＭＤ为抗肌萎缩蛋白遗传性缺陷所致，基因定位于Ｘｐ２１．２，全长２．４Ｍｂ，有７９个外显子，为迄今人类认识的最大的致病基因。ＤＭＤ基因庞大，突变发生率高，突变类型复杂多样，包括单个或多个外显子缺失，基因片段重复，单个碱基互换、缺失或插入等［３４］，患儿的临床表现与病情程度有关。通过先症者和母亲基因组比对，可以明确致病基因，用于靶向设计捕获探针进行ＮＩＰＤ。无创产前诊断常染体隐性遗传病，例如ＣＡＨ也需要对双亲及先症者的核心家系（ｔｒｉｏｓ）基因组ＤＮＡ进行比对分析，确定致病位点和信息ＳＮＰ。
３．３ 胎儿游离ＤＮＡ比例低 另一个利用孕妇外周血进行单基因疾病无创产前诊断面临的主要挑战是：①母体ＤＮＡ高背景；②ｃｆｆＤＮＡ与母源性ＤＮＡ高度相似，只有一个或几个碱基的差别［３５］。准确定量胎儿游离ＤＮＡ比例是无创产前诊断单基因病的前提。如果有一个可靠的、费用低廉的方法选择性地富集母体血浆中短片段ｃｆｆＤＮＡ的方法，检测胎儿ＤＮＡ序列将大大简化。虽然随着二代测序和数字ＰＣＲ技术的发展有了些进步，但很难在大范围的实验室实现这些检测条件，这些技术离常规临床检测仍然还很远。
４ 无创产前诊断单基因病的前景
４．１ 部分单基因病无创产前诊断技术已应用于临床 英国是无创产前诊断单基因病技术临床转化最好的国家之一。英国国民医疗保健（ＮａｔｉｏｎａｌＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮＨＳ）遗传学实验室提供基于ｃｆｆＤＮＡ的单基因病ＮＩＰＤ，目前已经应用于临床实
０３盐卤水
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践的常染体显性遗传和新发突变单基因病检测项目包括软骨发育不全、致死性侏儒、Ａｐｅｒｔ综合征、及排除性诊断父系遗传的囊性纤维化突变基因［３６］，这些技术在过去几年已逐渐被应用到
其他欧洲国家临床遗传实践中。但由于单一单基因遗传病发病几率低，需要基于特定疾病专门定制检测方案且检测方法和工作流程复杂，没有良好的商业前景，不容易普及。然而，现实中十分需要单基因疾病ＮＩＰＤ，尤其是有地域特征的单基因遗传病，例如世界范围内最常见的单基因遗传病 地中海贫血，发展无创产前诊断技术意义重大，目前很多研究以地贫作为疾病模型进行单基因病ＮＩＰＤ研发，也取得令人瞩目的进步。相信随着技术和数据分析的不断进步将有助于扩大ＮＩＰＤ测试范畴。
４．２ 技术进步带动单基因病无创产前诊断技术的发展 连锁标记构建单倍体为无创产前诊断单基因病更广泛的应用带来了希望。但使用基于连锁信息ＳＮＰ的ＲＨＤＯ分析进行单基因常染体隐性遗传病ＮＩＰＤ的局限性在于该方法通常应用于有先症者或纯合子儿童的家庭。对于无先症者的携带者夫妇，ＮＩＰＤ更具挑战性。令人振奋的进展是２０１６年，Ｌｏ［３７］团队研发了的一种普遍适用于单基因疾病ＮＩＰＤ的概念验证研究方法，这种方法可以不依赖先症者提供特定疾病的突变或ＤＮＡ信息。研究者将长ＤＮＡ片段化并用条形码（ｂａｒｃｏｄｅ）标记，深度测序后，基于条形码将ＤＮＡ片段重新组装成单倍体，然后进行母体血浆ＤＮＡ测序和ＲＨＤＯ分析，以推测胎儿的突变状态。但该检测方案操作繁琐，耗时长，费用昂贵，目前还在进行该方法灵敏度和准确性的评估，尚未成熟应用于临床实验。相信经过科学家们的探索，总有一天能到便捷、准确、经济的检测方式应用于临床。
５ 结语
继无创产前诊断胎儿非整倍体在全球范围内广泛应用于临床实践后，无创诊断单基因遗传病已经得到越来越多的关注，随着现代生物技术与生物信息统计学的快速发展和不断完善，更多无创产前诊断单基因遗传疾病的方法应用于临床实践将是指日可待。
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