[研究背景]
TH 细胞在抗原刺激下可以分化为TH1细胞和TH2细胞, 这两种TH 细胞亚均参与了细胞因子的合成与分泌。TH1细胞是变态反应和细胞免疫中重要的效应细胞,分泌TH1类细胞因子如IL-2、IFNγ、IFN、IL-12 和IL-18等。TH2细胞则分泌TH2类细胞因子如IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13和GM-CSF等。TH1细胞和TH2细胞之间的比例和功能失调是哮喘的主要免疫学发病机制,表现为TH2细胞数目增多和功能亢进。TH2细胞所产生的IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等多种细胞因子都参与哮喘的发病。研究表明尤其是IL-4、IL-5在哮喘的病程中起重要作用。哮喘病产生IL-4、IL-5棉鞋里的阳光教学设计的水平明显高于正常组, 呈现TH2型优势[1]IL-4可以诱发T细胞增殖王潮歌老公,使未定型T细胞分化为TH2细胞。IL-4可以促使B细胞增殖生长并诱导B细胞分化为浆细胞, 进而产生IgE、IgG4,参与哮喘变态反应性炎症的发生与发展。IL-4还能促进VCAM1等粘附分子的表达,参与炎症细胞的趋化与聚集过程[2]。除IL-4的重要作用外,许多研究已证实IL-5的表达与哮喘等变态反应性疾病密切相关。IL-5的表达与过敏性哮喘患者的气道高反应性相关, 并且嗜酸粒细胞在气道局部的聚集起关键作用, 是较强的嗜酸粒细胞增殖与趋化因子。I
L-5促使嗜酸粒细胞活化, 并诱导嗜酸粒细胞释放阳离子蛋白等毒性蛋白颗粒、炎症介质增加及产生过氧化物阴离子等增多。IL-5还可以通过抑制嗜酸粒细胞的凋亡而增强嗜酸粒细胞的存活力[3]。IL-13也有促进B 细胞增殖、活化, 诱导粘附分子表达的作用, 并可选择性的使嗜酸粒细胞、淋巴细胞聚集。IL-3 和GM-CSF 等细胞因子也在嗜酸粒细胞的活化、延长生存期及脱颗粒中起重要作用。TH1型细胞因子IL-2、L12等也在哮喘的免疫调节中起重要作用。IL-12参与TH细胞分化的调节。IL-12抑制TH2类细胞因子IL-4、IL-5的产生,促使TH细胞向TH1细胞分化,抑制其向TH2 细胞分化。IFN有同样作用,并可阻断IgE的合成。IFN和IL-12诱导TH1细胞产生的能力,而IL-12本身又能诱导IFN产生。这样,形成一个正反馈调节,加强TH1型的免疫反应,而抑制了TH2 型的免疫反应。近来,在动物实验及临床观察中都证实,外源性的IFN、IL-12可以有效抑制过敏原所诱导的气道高反应性。以上说明TH1/TH2比例、功能的失衡是哮喘的重要免疫学发病机制。 设计本实验的目的是研究卡介苗在哮喘中应用的免疫学基础，对人类哮喘的[4]有一定的价值意义。
[研究目标力元新材]
1.通过本设计实验，探讨卡介苗(BCG)对哮喘BALB/c小鼠外周血及肺泡灌洗液(BALF)中淋巴细胞凋亡的影响。
2.进一步了解和掌握科学研究的基本思路和基本过程，并通过实验提高对科研的认识和兴趣，熟练掌握免疫学实验常用技术和仪器设备的使用。
[实验方案]
1.实验材料：卡介苗(BCG),22型分光光度仪,自制小鼠雾化吸入箱,卵蛋白干粉(OVA),荧光显微镜。
2.实验动物:10周龄BALB/c小鼠30只,雌雄不限,体重(10∀2)g。
3.实验分组：将30只小鼠随机分为三组，每组十只，分别为阳性对照组、阴性对照组和BCG组。
[观察指标]
1.测肺泡灌洗液(BALF)和淋外周血中淋巴细胞凋亡率。
2.测肺泡灌洗液(BALF)和淋外周血中DNA损伤率[5]。
2003赤裸天使[实验方法及步骤]
1.阴性对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.1ml,14天后用37℃生理盐水雾化吸入,共3天,每天1次,每次30min。
2.阳性对照组小鼠腹腔注射10%OVA 0.1ml,14天后以1%OVA超声雾化吸入,通过雾化吸入箱15 min后放入小鼠持续雾化30min激发,连续3天,观察小鼠反应,以烦躁不安,呼吸急促,腹肌抽搐,大、小便失禁为阳性反应。
3.BCG组哮喘模型制作同阳性对照组,但每次雾化吸入前30 min每只小鼠腹腔注射BCG0.04 mg激发3次后用25%乌拉坦0.15 ml肌注麻醉小鼠,处死后取外周血1ml,以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
4.用Comet法检测淋巴细胞凋亡率,二甲苯胺法计量DNA损伤率;同时游离气管,横切环状软骨,置入连接注射器的硅胶管,分三次缓慢注入37℃去钙、镁离子Hank 平衡液,分次注入0.7、0.6 及0.5 ml,每次灌洗后立即抽吸,收集BALF1ml。
5.离心后加入淋巴细胞分离液中提取淋巴细胞,同样以Comet法测淋巴细胞凋亡率,以二甲苯胺法测DNA损伤率。
[预期结果分析]
1.BCG组外周血中的淋巴细胞凋亡率及DNA损伤率均高于阳性对照组。
2.在BALF中,BCG组的凋亡率及DNA损伤率也高于阳性对照组。
3.阴性对照组的各项指标BCG组相比,均无明显差异。
[浙江同志可行性分析]
1.本实验设计方案合理，分组、对照实验兼有。
2.金宏柱卡介苗对哮喘小鼠淋巴细胞凋亡的影响已有研究。
3.技术方法和技术路线可行，我们通过对生理学、组织学及免疫学的基础理论和实验学习，可以将此实验很好的进行下去。同时，此实验设计方案较为简单，我们可以很好的把我每一步骤的要点操作，从而完成本实验。
[参考文献]
Kang DH et al.[J]J Interferon and cytokinerese arch,1997; 17:481-487.
Ryan JJ.[J]J Allergy Cl in Immunol,1997;99:1-5.
Bittleman D et al.[J]Am J Respir Crit Care d,1994;150:72-76.
余衍亮,孙秀明,李翠莉,等.卡介苗对哮喘豚鼠的影响.中国呼吸与危重监护杂志,2002;1:154-156.
张世馥,林彭年.细胞器及细胞间质的分离技术.见:张均田,主编.现代药理实验方法.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998;277-294.
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