h2o2
重组人HMGB1 Abox的表达纯化及单核细胞的抑制作用高迁移率族蛋白(highmobilitygroupboxehromosomalprotein，HMGB)于上世纪60年代发现，是一族含量丰富的非组蛋白核蛋白，是细胞内广泛存在的DNA结合蛋白，氨基酸组成序列在生物进化过程中高度保守，因其在凝胶电泳中泳动速度快而得名。除细胞核外，HMG也存在于多种细胞细胞质和细胞膜上。所有的HMGB蛋白通过HMGB box与DNA结合。HMGBboX由组成a螺旋结构的氨基酸残基序列组成，与DNA小沟形成非特异性结合。HMGB家族包含三个相关的高度保守的成员:HMGB1、HMGB2、HMGB3，这三个家族成员有85%的同源性，在其梭基末端的酸性尾部都含有 Abox蛋白和 Bbox蛋白。 Abox蛋白和 Bb0X蛋白有较高的同源性，分别由80个氨基酸残基组成。在培养的巨噬细胞中分别加入HMGBI及 BboX蛋白，结果显示经二者刺激后均有较高水平的TNF一细胞因子的产生，使用 Bbox蛋白的抗体后显示二者TNF一。的产生水平明显降低，表明HMGBI致炎部位在 Bbox蛋白。同样在巨噬细胞中加入 AboX蛋白后可以明显降低HMGBI刺激后TNF一。的产生水平。表明 Abox蛋白起到了抑制炎症的作用健康724。 目前认为HMGBI以主动分泌和被动释放两种方式到达细胞核外。体外研究表明，人类和小鼠 的单核细胞、巨噬细胞等在脂多糖的刺激下通过非经典途径主动分泌到细胞外，释放过程包括蛋白质乙酞化和分泌溶酶体的胞吐作用，即主动分泌。另一个HMGBI释放的主要因素是由物理或化学损伤引起的细胞坏死或意外死亡。HMGBI与染体的结合较疏松，可在坏死细胞中通过破裂的细胞膜被动释放出来。
HMGBI是新近发现的炎性细胞因子，具有免疫刺激特性，在SLE等多种自身免疫性疾病和脓毒血症的免疫病理过程中具有重要作用钱德勒。HMGBI及其受体RAGE介导免疫复合物刺激DC和B细胞活化及细胞因子产生;SLE患者血清及血浆中HMGBl蛋白的水平显著增高，提示HMGBI参与SLE等由免疫复合物所致疾病的免疫病理，在sLE的发生发展中起着重要的作用。系统性红斑狼疮(sLE)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其主要特征是对核内自身抗原产生自身抗体。近来有研究发现在SLE的血清中DNA相关的免疫复合物浓度明显升高。而这些由自身抗原形成的免疫复合物在循环中具有致病性。体外实验发现HMGBI与CpGAODNS相互作用，产生的复合物通过衔接蛋白Myoss和RAGE激活pnes，并显著增加IFN一Y和TNF的产生。Hua等研究证实DNA相关免疫复合物可通过DNA和TLRg依赖机制激活自身反应性B细胞。而HMGBI正存在于这些复合物中并对激活自身反应性B细胞具有重要的作用。
温州眼镜大王Kokk。等对实验性关节炎大鼠的关节组织进行了免疫组织化学染，结果显示滑膜细胞与巨噬细胞的细胞质和细胞外HMGBI的表达明显增高，而对正常大鼠的同一部位进行染显示HMGBI主要局限于细胞核中。深入研究发现，在胶原或佐剂诱导关节炎模型中，在关节炎症状显现之前HMGBI已先于TNF一Q和工L一lp的表达发生了核转位，并在症状明显时达到高峰〔驹。除了动物模型外，类风湿关节炎(theumatoidarthritis，RA)患者滑膜组织和滑液中HMGBI表达水平显著上升，同时在活动期RA病人血浆中HMGBI蛋白的表达水平亦有显著增高并且同血中红细胞沉降率及C反应蛋白的水平相一致。KokkOla等和AnderSSOn等分别将抗HMGBI抗体和重组Abox蛋白注射入患有胶原诱导性关节炎的小鼠体内，结果显示，两者均可使小鼠发病关节数量减少，体重下降程度减轻和关节炎症状明显改善。免疫组织化学染后还发现关节局部分泌IL一lp的细胞数目减少，软骨组织的破坏程度明显减轻，而撤消HMGBI特异性阻断剂后，小鼠又会表现出明显的关节炎症状。说明HMGBI不仅在RA患者中的表达水平升高，而且是RA治病的重要作用因素。
在脓毒血症中晚期，HMGBI水平才明显升高，研究表明，HMGBI升高与血清中TNF一a，、IL一 lp\lL一6等炎性细胞因子的水平上调有关。当细胞坏死或受损时，在TNF的作用下核内的HMGBI可释放到胞外，引发单核巨噬细胞分泌促炎因子;而促炎因子又可进一步促
进HMGBI的分泌，形成正反馈环。在炎性反应的后期，这种正反馈效应对炎性反应的维持具有重要的作用。HMGBI的致炎部位位于 Bbox蛋白，应用 Bbox蛋白的特异性抗体能显著提高脓毒症动物模型的生存率。
HMGBI蛋白中 Bbox蛋白是引起炎症反应的结构， Abox蛋白是抑制炎症发生的结构，因而 HMGBIAbox作为HMGBI拮抗剂，有可能用于SLE等自身免疫性疾病和脓毒血症的。先前的研究表明 Bbox蛋白同炎性细胞作用后可以显著的增加血清中TNF一Q，工L一lp，and工L一6等炎性细胞因子的水平。同 Bbox蛋白相反， Abox蛋白加入到在体外培养的巨噬细胞后，可以降低HMGBI诱导的TNF一a，IL一1旦细胞因子的表达水平，并且这一现象同 AboX蛋白的加入量成正相关「8〕。本研究亦发现HMGBI Abox蛋白可明显的抑制免疫复合物诱导的TNF一及IFN一Y等炎性因子的分泌，结果与先前的研究相符。
单核细胞通过分泌多种细胞因子参与炎性疾病和自身免疫病的免疫病理。B细胞的异常活化是SLE免疫病理的核心之一，而单核细胞产生的BAFF作为B细胞活化因子，在sLE的发生发展中具重要作用〔33一3‘〕。目前认为在未成熟自身反应性B细胞的阴性选择过程中，当由BAFF介导的促生存信号超过阴性选择凋亡信号时，自身反应性B细胞可以逃避凋亡并
发育成熟。所有的BAFF转基因小鼠都有外周B细胞增多，并伴有自身反应性抗体的产生，以及肾炎一狼疮样自身免疫性疾病的典型特征「35〕。大量的实验证据表明BAFF可以作为B细胞介导的自身免疫性疾病的靶点。BAFF的抑制剂可以减短B细胞的生存周期，减少外周血中B细胞的数量(其中也包括自身反应性B细胞)，从而减少自身反应性抗体的产生和抗原的呈递。本研究首次发现重组人HMGBIAbox可明显抑制免疫复合物诱导的BAFF的表达，为其用于SLE的提供了理论依据。
HMGBIAbox蛋白可以明显的抑制1C刺激单核细胞后TNF一。、IFN一Y和BAFF
的分泌，表明所制备的 HMGBIAbox蛋白具有显著的生物活性，为SLE等自身免疫性
疾病和炎症性疾病的提供新的方法和途径.。（有综述）
人HMGB1 Abox及Bbox cDNA的克隆、表达及功能鉴定
最近的研究发现，高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)，一种广泛存在的、高度保守的细胞核非组蛋白,主要在核内参与核蛋白复合体组成、基因转录调节等。当其释放至胞外时，可作为晚期致炎因子介导炎症反应，同时HMGB1本身也能刺激
单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等分泌TNF、IL-1、IL-6等致炎细胞因子。大量的报道证实，HMGB1与炎症的发生、发展密切相关，成为潜在的介导炎症的中心[1-5]。人HMGB1全长含215个氨基酸残基，其中有2个约80个氨基酸残基组成的HMG “box”，分别是A box(1-85氨基酸)和Bbox(88-162氨基酸)。经结构功能分析，HMGB1的致炎活性主要位于B box，而A box 却对HMGB1全长及B box诱导细胞分泌致炎因子有一定的拮抗作用[6]。 因此，HMGB1有望成为抗炎时药物设计的新靶点[7, 8]。高迁移率族蛋白 B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)，属于高迁移率族蛋白超家族成员，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得名。HMGB1 是一种广泛存在的、高度保守的细胞核非组蛋白,主要在核内参与核蛋白复合体组成、DNA 的复制、转录、修复以及细胞运动等[9-12]。最近的研究发现，HMGB1 可释放至胞外介导炎症反应，与多种炎症的发生和发展密切相关，如脓毒症、肺炎、类风湿性关节炎等[13-20]。相对于 TNF、IL-1 等早期致炎因子，HMGB1 是一个重要的晚期致炎因子[1-5]，具有更宽的临床窗口期，因此，特异地抑制 HMGB1 的释放和活性是一种非常有希望的抗炎策略，尤其是炎症晚期所引起的脓毒症。此外，HMGB1 可作为趋化性细胞因子，与肿瘤的生长、侵袭与转移相关，如乳腺癌、前列腺癌、胃肠道肿瘤等[21-25]，从而使其成为抗肿瘤的靶分子。人 HMGB
1 由 215 个氨基酸残基组成，其中有两个能结合 DNA 的结构域，分别是 A box (1-85 氨基酸)和 B box (88-162
氨基酸)，HMGB1 的 C 端(又称酸性尾端，“acidic tail”)，富含天冬氨酸和谷氨酸，其
氨基酸序列高度保守。经结构功能分析，B box 是 HMGB1 发挥致炎功能的主要区域，
而有趣的是，A box 却对 HMGB1 全长及 B box 诱导细胞分泌致炎因子有一定的拮抗
作用[6]，而成为 HMGB1 的拮抗剂。
一、HMGB1 A box 及 B box cDNA 的克隆
人 HMGB1 全长 215 个氨基酸残基，其中 1-85 氨基酸残基为 A box，具有抑制HMGB1 及 B box 诱导致炎细胞因子产生的功能，88-162 氨基酸残基为 B box，是HMGB1 发挥致炎功能的主要功能区域。因此，我们克隆了 HMGB1 A box 及 B boxcDNA，以进一步研究其生物学功能。
HMGB1 广泛表达于多种细胞，包括造血干细胞来源的细胞(如单核/巨噬细胞、嗜中性粒细
十二五末期
胞和血小板)、成纤维细胞、神经元、神经胶质细胞、肝细胞等。HMGB1 在扁桃体的表达量较高，且较易获得，因此我们选用了手术切除的新鲜扁桃体组织提取总 RNA
重组蛋白 HMGB1 和 HMGB1 B box 能有效地刺激单核细胞分泌 TNF-α、IL-6。由于 HMGB1 A box 具有抑制 HMGB1 及 B box 诱导致炎因子产生的功能，我们也用同样的方法证明了重组蛋白 HMGB1 A box 具有相应的活性。
HMGB1通过两种方式释放至胞外发挥作用。一是：细胞的主动分泌。由于HMGB1缺乏前导链，因此不能经Golgi/ER途径分泌，而是依赖于分泌型溶酶体(一种存在于胞质内的特殊细胞器)的重新分布后, 再经分泌型溶酶体的胞吐作用被分泌至于胞外的。其过程是：胞质内的HMGB1首先被造血细胞内的分泌型溶酶体吸收，然后含有HMGB1的分泌型溶酶体与细胞膜融合，当细胞被胞外的磷脂酰胆碱或ATP激活后即可分泌HMGB1。巨噬/单核细胞主动分泌HMGB1的过程中，LPS、IL-1、TNF等炎症信号可引起核内HMGB1的特异性赖氨酸乙酰化，而赖氨酸残基的乙酰化可促进HMGB1从核内到胞质的移动，从而阻止HMGB1折返核内，这一点是HMGB1分泌到胞外所必需的条件。另一方式是：细胞的被动释放。HMGB1可由坏死细胞被动释放。而调亡细胞由于核HMGB1与DNA紧密结合，而不
吴栓牢能释放HMGB1。调亡细胞核内之所以能保留HMGB1，与细胞调亡过程中核内的组蛋白未发生乙酰化相关，而细胞核内组蛋白发生乙酰化的程度决定了HMGB1与DNA的亲和力的高低，低程度的乙酰化将导致HMGB1与DNA的高亲和力。如果调亡细胞的组蛋白修饰被阻止，则调亡细胞无法再保留HMGB1，将会变成与坏死细胞一样释放HMGB1，而诱发炎症。这两种不同的HMGB1释放的机制，说明了HMGB1作为内源性危险信号介导炎症的重要性。也说明了，HMGB1既可作为炎症的早期启动子(由坏死细胞被动释放)，也可作为炎症的晚期启动子(由单核/巨噬细胞主动释放)。但值得我们注意的是坏死细胞被动释放HMGB1和活化的巨噬细胞主动分泌HMGB1之间存在着分子差异性，这种功能性的因果关系目前尚不清楚。
HMGB1释放至胞外后，作为一种细胞因子通过受体特异性地与靶细胞结合，从而触发和参与炎症反应。研究发现，晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation
end-products，RAGE )是HMGB1发挥作用的重要受体之一。目前HMGB1相关的细胞信号转导机制尚不清楚，但已经明确的是多种细胞因子作用的共同途径之一的JAK/STAT信号转导通路对HMGB1的表达具有调节效应。在CLP动物模型中,观察到脓毒症时JAK/STAT通路
高度活化,HMGB1基因表达亦显著升高,且肝、肺、肠组织中STAT1、STAT3分别与相应器官HMGB1 mRNA 表达呈显著正相关。此外，HMGB1刺激大鼠腹膜巨噬细胞，能活化STAT1、STAT3和JAK2。大鼠神经胶质细胞瘤细胞受HMGB1刺激后，能活化P21ras、MEK、MAPK，并能引起NF-κB的活化。大鼠平滑肌细胞、初级巨噬细胞和树突状细胞受HMGB1刺激后，也出现相同的胞内信号通路。这些信号通路与调节HMGB1表达，诱导炎症反应密切相关。
经结构功能分析，HMGB1 全长和 HMGB1 全长中的 B box 均能诱导炎症，其中 Bbox 诱导细胞分泌致炎因子的能力较 HMGB1 全长弱一些。而 A box 却能抑制 HMGB1全长及 B box 诱导致炎细胞因子的产生[6]，其机制可能是 A box 能竞争性抑制 HMGB1与受体结合，从而抑制 HMGB1 的致炎活性。也可能是全长中的 A box 作为 B box 活化的辅助因子，当单独的 A box 竞争性结合受体后，抑制了全长中的 A box 对 B box 活化的辅助作用，从而抑制了 B box 的致炎作用，目前这一作用机制尚不十分清楚，因此，我们对 HMGB1 A box 及 B box 的克隆和表达将为进一步研究其作用机理奠定基础。
七、HMGB1 与炎症的发生与发展
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