穆 王君 史 斌
(首都医科大学附属复兴医院内科)
摘要：目的 探讨高浓度葡萄糖作用于脐静脉内皮细胞后，对脐静脉血管内皮细胞系的活力和白细胞黏附分子 血管细胞黏附分子-1(VCA M-1)、细胞间黏附分子-1(I CAM-1) 表达的影响，为阐明高血糖在糖尿病血管病变的早期发病中作用与机制提供依据。方法 采用胎盘蓝染法及流式细胞仪检测细胞活力和黏附分子表达。结果 高浓度葡萄糖可使内皮细胞的死亡率增加,ICAM-1表达显著上调，但V CAM-1表达无明显变化。结论 减少高糖诱导的ICAM-1、VCA M-1表达增加，对减少糖尿病患者慢性并发症的发生概率是一条有益的途径。
关键词：血管内皮细胞；葡萄糖浓度；黏附分子
中图分类号:R322.1+2
Effects of High Glucose C oncentration on Adhesion Molecules Expression and Survival in Cultured Human Umbilical Vein Endothelial Cells
M u Jun,Shi Bin
(Dep ar tment of I nter nal M edicine,Fux ing H osp ital,Cap ital University of M edical Sciences)
ABSTRAC T:Objective T o investigate whether or not survival was decreased after incubation w ith high glucose concentrations in culture media,and to examine t he effects o f g lucose on the ex pression of intercellular adhesion molecule-1(I CAM-1)、vascular cell adhesion molecule(V CAM-1)in cultured human umbilical vein endothelial cells.Methods Human umbilical v ein endot helial cells (ECV304)were incubated in a culture medium with11.2mmol/L,16.8mmol/L and33.6mmol/L glucoseco ncentrations for24 h,48h,72h respectively.T he trypan-blue exclusion test w as used to study the influence of D-glucose on cell sur vial.T he ex pression of intercellular adhesion molecule-1(I CAM-1),vascular cell adhesion molecule-1(VCA M-1)w er e measured by flow
收稿日期:2004-03-25
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2005年 6月第26卷 第3期
首都医科大学学报
Journal of Capital University of Medical Sciences
Jun.2005
Vol.26 No.3
cytometry.Results When D-g lucose concentrations rose tr ypan-blue excluded cells were decreased.HU VEC exposed to a hig h g lucose concentration(33.6mmol/L)show ed a1.22-fold increase and a1.27-fold increase in cell surface ex pression o f ICA M-1 after48h and72h exposure compared w ith those cultured in medium with a low glucose concentration(5.6mmol/L).C onclusion Hig h concentration of g lucose can arrest t he proliferative response and show that even a short-term ex posure o f endothelial cells (ECs)to high glucose concentration leads to their activ atio n associated w ith increased ex pression of adhesio n molecules such as ICA M-1and that this effect may appears more sig nificantly along wit h time of ex posuring high concentration of glucose.
Key words:endothelial cell;glucose concentr atio ns;adhesion molecules
糖尿病因伴有严重的大血管和微血管并发症而造成患者死亡率增加，其中内皮细胞(EC)功能损害是血管病变起始的关键因素之一。很多因素(如脂质代谢紊乱、高血压、高血糖等)可促使血管病变的发生。高血糖是糖尿病患者独有的检测指标，血管内皮细胞是最早受到高血糖影响的部位，血管早期损伤机制的阐明有助于推迟或阻止糖尿病血管损伤的发展。本研究用含高浓度葡萄糖(Glu)的培养液培养血管内皮细胞后，观察内皮细胞的增生和黏附分子表达的变化规律，以了解高血糖在血管病变早期的作用。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
脐静脉内皮细胞系(ECV304)由解放军总医院母义明主任及金文胜博士惠赠，复苏后放在75 cm2的细胞培养瓶中，加入含有15%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100U/m L的DM EM低糖完全培养液,37 5%CO2条件下培养，约2~3 d细胞80%铺满底后，用0.25%胰酶/EDTA液消化约2min后传代。部分细胞继续传代培养，其余部分收集计数后加入细胞冻存液二甲亚矾(DMSO),-80 冻存备用。
1.2 实验分组
1)对照组：正常生长内皮细胞，培养液葡萄糖浓度为5.6mmol/L。2)实验组：分为3组，培养液葡萄糖浓度分别为11.2、16.8、33.6mmol/L，各浓度组分别培养不同时间(0、24、48h)。
1.3 检测方法
1)细胞活力的测定：选取生长良好细胞，以8 104/mL接种于24孔细胞培养板上，约8~10h细胞贴壁后，培养过夜，一部分孔细胞用0.25%胰酶/EDTA液消化，所得细胞用0.4%胎盘蓝染1 min，细胞计数板上计数，其余细胞换液后分别加入葡萄糖浓度为5.6、11.2、16.8、33.6mmol/L的DMEM培养液，各浓度分别培养24h和72h。培养到预定时间后，如前述方法消化细胞,0.4%胎盘蓝染1min后，细胞
计数板上计数。
2)流式细胞仪检测：选取生长良好的细胞，以6 105/孔铺6孔板，细胞贴壁后，培养过夜，分别加入葡萄糖终浓度为5.6、11.2、16.8、33.6mmol/ L的DMEM培养液，培养0、24、48和72h。各浓度培养到预定时间后，分别消化、收集细胞,1000 r/min低速离心5min后,PBS洗涤并调整细胞密度，每50 L约5 105细胞。各管分别加入PE标记的ICAM-1抗体5 L及FITC标记的VCAM-1抗体5 L，混匀；室温下避光孵育30m in。上机前取出试管,1000r/min离心5min，弃上清；各加PBS液250 L，上机检测，检测时每个样本分析2万个细胞。
2 结果
2.1 不同浓度葡萄糖培养液对EC生长和死亡的
影响
对照组(5.6mmol/L葡萄糖)内皮细胞生长呈现典型的线形增生反应。而暴露于高浓度葡萄糖，培养24h后细胞数量较对照组明显增加(P< 0.05)，继续暴露于高浓度葡萄糖出现增生反应的停滞，导致72h时出现细胞数量减少(P<0.01，表1)。与对照组相比，各组细胞在24h的培养中死亡率相似，而72h时，高浓度葡萄糖组细胞死亡率明显高于对照组(表2)。
2.2 不同浓度葡萄糖培养液对IC AM-1和
VC AM-1的影响
表1 不同浓度葡萄糖作用24和72h细胞数的变化
Tab1 Cell number after24h or72h exposure to
different glucose concentration( x s)104 Group 24h72h
Control22.5749.40
小撒探会11.2mmol/L29.95*40.20
16.8mmol/L28.82*38.55
33.6mmol/L23.4134.02
*P<0.05vs control; P<0.05, P<0.01v s24h.
316首都医科大学学报第26卷
EC细胞在正常葡萄糖浓度(5.6mmol/L)时，可见细胞间黏附分子-1(ICAM-1)有基本的表达，在高浓度培养48h后表达明显上调(P<0.05)，培养72h时33.6mmol/L葡萄糖组可见到ICAM-1表达的继续上调，与11.2mmol/L、16.8mmol/L葡萄糖组比较差异有统计学意义(P<0.05，表3)。葡萄糖培养液在不同培养时间与不同浓度的情况下，对照组与3个实验组相比，血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)的表达均未见显著差异(P>0.05，表4)。
表2 不同浓度葡萄糖作用不同时间对EC死亡率的影响Tab2 Mortality of endothelial cells af ter exposure to diff erent glucose concentration for dif ferent
time( x s)% Group24h72h
Control 3.36 4.11
11.2mmol/L 3.35 5.31*
16.8mmol/L 3.347.19*
33.6mmol/L 3.988.52*
*P<0.05v s control group; P<0.01v s24h.
表3 不同浓度葡萄糖作用不同时间对IC AM-1的影响
Tab3 Effect of high glucose concentrations exposure f or dif ferent tim e
on expression of ICA M-1on endothelial cells( x s)
Group0h24h48h72h
5.6mmol/L989.78 29.401074.04 45.351003.51 69.90104
6.94 79.17
11.2mmol/L999.17 34.301046.40 70.011176.12 51.16* 1200.95 46.04*
16.8mmol/L1004.60 36.481094.90 67.361168.22 64.41* 1184.34 32.11*
33.6mmol/L994.91 35.171111.60 72.331221.23 36.43* 1270.51 30.39* *P<0.05v s5.6mmol/L group; P<0.05v s0h group; P<0.05vs33.6mmol/L group.
表4 不同浓度葡萄糖作用不同时间对VCA M-1的影响
Tab4 Effect of high glucose concentrations exposure f or dif ferent tim e
on expression of VC AM-1on endothelial cells( x s)
Group0h24h48h72h
5.6mmol/L32.91 3.3733.82 2.0933.86
6.893
7.17 2.40
11.2mmol/L31.25 5.2633.82 2.9135.74 7.7941.38 8.05
16.8mmol/L31.37 3.8333.44 1.2235.81 3.6235.91 8.05
33.6mmol/L33.11 5.9333.22 4.2235.50 8.0236.24 1.28
3 讨论
高血糖是糖尿病人特有的症状，持续的高血糖和正餐后血糖高峰在糖尿病病人中很常见，餐后血糖的升高可导致内皮素合成和释放增加，功能蛋白非酶糖化，炎性细胞因子和黏附分子表达增加，自由基生成增加。许多细胞对Glu的摄取是通过自身调节细胞膜上特异葡萄糖转运体来进行的，但EC缺乏这
种调节，因而为高浓度Glu损伤血管内皮创造了条件。Abe等[1]研究发现高浓度Glu (28.0mmol/L)作用于视网膜微血管内皮，培养10 d后，细胞数量减少78%。Su等[2]人的研究表明高浓度Glu培养VEC24~96h期间，生长静止期(G0、G1)期细胞增多,DNA合成期(S)细胞数量下降。我们的研究也证实高浓度Glu在培养24h时细胞死亡率与对照培养液相似，细胞数量增加，但随培养时间增加，细胞死亡率增高，细胞数量减少。本研究的结果显示，在高浓度葡萄糖培养的条件下，培养时间的延长较葡萄糖浓度的升高对EC细胞生长的影响更大。
高浓度Glu损伤EC的机制主要是: 多元醇途径活性增强，导致细胞生长必需的肌醇减少及胞内山梨醇聚集导致高渗透压; 非酶糖基化及糖基化终末产物(AGEs)的形成,AGEs引起EC增生异常，并促进EC死亡; 高糖状态下产生过多的氧自由基对EC产生严重的毒害作用。 高糖作用下一些细胞因子如TGF- 1产物的自分泌释放[3,4]。
糖尿病是导致动脉粥样硬化(AS)内皮功能损害的主要原因，在AS早期，单核细胞与血管内皮细胞黏附、迁移起到始动作用，细胞之间、细胞与基质之间相互黏附和相互作用贯穿了AS的整个病理过程。白细胞的黏附是由黏附分子如ICAM-1、VCAM-1在内皮细胞表面诱导下完成的。在临床观察中，发现伴有心血管和微血管并发症(视网膜病变、肾脏病变)的糖尿病患者,VCAM-1水平高
317
第3期穆 王君等：高浓度葡萄糖对培养血管内皮细胞活力和黏附分子表达的影响
于无并发症的糖尿病患者和正常对照组[5~7]。在实验研究中，也已有各种刺激因素(mmLDL、rT NF )使黏附分子表达增加的报道[8,9]。本研究发现，高浓度Glu使ICAM-1表达增加，并呈时间依赖性，说明在短时间内，葡萄糖浓度轻微的升高就会促使ICAM-1表达增加，随着培养时间延长，高浓度的葡萄糖会进一步诱发黏附分子表达水平的增加，使内皮功能损伤进一步加重。而高浓度葡萄糖在培养72h并未使VCAM-1水平增加，可能有2方面因素:1)高浓度葡萄糖并不是VCAM-1表达刺激的直接因素,2)高浓度葡萄糖作用的时间和浓度不足以增加VCAM-1的表达。Ciro等[10]研究发现在培养的牛主动脉和人微血管内皮细胞长期(8周)置于高浓度葡萄糖，可使VCAM表达增加的药物，并诱导内皮细胞与单核细胞黏附。已有研究发现高糖诱导的ICAM-1、VCAM-1表达增加，是经由蛋白激酶C途径完成的[10,11]。因此，抑制上述途径有可能减少动脉粥样硬化的发生。现已发现，磺脲类药物格列齐特在体外培养的内皮细胞中可通过抑制蛋白激酶C途径降低高糖引起的ICAM-1、VCAM-1表达增加[12]；因此在新的和现有的糖尿病的药物中发现是否有在降低血糖的同时可减少ICAM-1、VCAM-1表达增加的药物，对减少糖尿病患者慢性并发症的发生率也许是一条有益的途径。
三自由度平台4 参考文献
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318首都医科大学学报第26卷
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