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王迪迪，刘秋圆，胡 翠，王兵兵，韦亚蓉，丁 浩，刘晓昌，梅
俏安徽医科大学第一附属医院消化内科，合肥
２３００２２摘要：目的 探讨急性胰腺炎（ＡＰ）患者血浆内皮细胞微粒（ＥＭＰ）水平的改变并初步观察其形成的机制。方法 收集安徽医科大学第一附属医院２０２０年８月—２０２１年６月６０例ＡＰ患者的血液标本，分为轻症急性胰腺炎组（ＭＡＰ组，ｎ＝２３）、中度重症急性胰腺炎组（ＭＳＡＰ组，ｎ＝２３）和重症急性胰腺炎组（ＳＡＰ组，ｎ＝１４），取健康体检者２０例为对照组。使用差速离心法获得贫血小板血浆，流式细胞仪检测ＣＤ３１＋ＣＤ４１－ＥＭＰ水平，ＥＬＩＳＡ检测内皮素（ＥＴ－１）、血管性血友病因子（ｖＷＦ）、一氧化氮（ＮＯ）和血管内皮细胞黏附分子－１（ＶＣＡＭ－１）水平。使用ＡＰ患者的血浆刺激ＨＵＶＥＣ细胞，使用流式细胞术和ｑＲＴ－ＰＣＲ分别检测ＥＭＰ、细胞活性氧（ＲＯＳ）、线粒体膜电位的变化及内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）、诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）、细胞间黏附分子－１（ＩＣＡＭ－１）、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶及Ｐ－选择素的表达。符合正态分布的计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用ＬＳＤ－ｔ检验；不符合正态分布的计量资料组间和组内两两比较采
用Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓＨ秩和检验。计数资料组间比较采用χ２检验。相关分析采用Ｐｅａｒｓｏｎ相关性检验。
结果
与对照组相比，ＭＡＰ组、ＭＳＡＰ组、ＳＡＰ组ＥＭＰ水平均明显升高（Ｐ值均＜０．０５）。与ＭＡＰ组、ＭＳＡＰ组比较，ＳＡＰ组ＥＭＰ水平明显升高（Ｐ值均＜０．０５）。ＡＰ患者ＥＭＰ水平与ＡＰＡＣＨＥⅡ评分、ＢＩＳＡＰ评分、Ｒａｎｓｏｎ评分、ＣＴ评分、ＣＲＰ均呈正相关（ｒ值分别为０．６８６２、０．７７７３、０．７１３８、０．７７１８、０．４７３９，Ｐ值均＜０．０１）。与对照组相比，ＭＡＰ组
、ＭＳＡＰ组、ＳＡＰ组的ＥＴ－１、ｖＷＦ、ＶＣＡＭ－１水平明显升高，ＮＯ水平明显降低（Ｐ值均＜０．０５）。与对照组相比，ＭＳＡＰ和ＳＡＰ组血浆可促进ＨＵＶＥＣ中ＥＭＰ大量释放（Ｐ值均＜０．０５）。与对照组比较，除ＭＡＰ组的ＶＣＡＭ－１和ｅＮＯＳ外，其余各组的ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、
ＩＣＡＭ－１、Ｐ－选择素、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶的ｍＲＮＡ表达水平均显著升高（Ｐ值均＜０．０５）。与对照组相比，ＭＡＰ组、ＭＳＡＰ
组、ＳＡＰ组、ＬＰＳ组患者ＨＵＶＥＣ中的ＲＯＳ水平升高明显，线粒体膜电位下降显著（Ｐ值均＜０．０５）。结论 ＡＰ患者血浆ＥＭＰ水平
明显升高，与胰腺炎严重程度相关，且ＡＰ患者血浆可刺激ＨＵＶＥＣ形成ＥＭＰ，机制可能与细胞氧化损伤相关。
关键词：
胰腺炎；内皮细胞微粒；内皮细胞ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－５２５６．２０２２．０９．０２７
收稿日期：２０２２－０１－１７；录用日期：
２０２２－０２－２０
通信作者：梅俏，
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ｉａｌｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ
ＷＡＮＧＤｉｄｉ，ＬＩＵＱｉｕｙｕａｎ，ＨＵＣｕｉ，ＷＡＮＧＢｉｎｇｂｉｎｇ，
ＷＥＩＹａｒｏｎｇ，
ＤＩＮＧＨａｏ，
ＬＩＵＸｉａｏｃｈａｎｇ，ＭＥＩＱｉａｏ．（
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ ｇｙ，
ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
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ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ
ａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（ＡＰ）
．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ６０ｐａｔｉ
ｅｎｔｓｗｉｔｈＡＰｗｈｏｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｉｎＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｒｏｍＡｕｇｕｓｔ２０２０ｔｏＪｕｎｅ２０２１，
ａｎｄｔｈｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｍｉｌｄａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（ＭＡＰ）ｇｒｏｕｐｗｉｔｈ
２３ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｍｏｄｅｒａｔｅ－ｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（ＭＳＡＰ）ｇｒｏｕｐｗｉｔｈ２３ｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（ＳＡＰ）ｇｒｏｕｐｗｉｔｈ１４ｐａ ｔｉｅｎｔｓ；２０ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓｗｈｏｕｎｄｅｒｗｅｎｔｐｈｙｓｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｐｌａｔｅｌｅｔ－ｐｏｏｒｐｌａｓｍａ，ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＣＤ３１＋
ＣＤ４１－
ＥＭＰｓ，ａｎｄＥＬＩＳＡｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１（ＥＴ－１），ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ），ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（ＮＯ），ａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＶＣＡＭ－１）．
ＨＵＶＥＣｓｗｅｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅｐｌａｓｍａｏｆＡＰｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄｔｈｅｎｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｑＲＴ－ＰＣＲｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎＥＭＰｓ，
ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ），ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｅＮＯＳ），ｉｎ ｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ），ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＩＣＡＭ－１）
，ＶＣＡＭ－１，ＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅ，ａｎｄＰ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ．Ａｏｎｅ－ｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｏｒｍａｌｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｄａｔａｂｅｔｗｅｅｎｍｕｌｔｉｐｌｅｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄｔｈｅｌｅａｓｔｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｔ－ｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓ．ＴｈｅＫｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓＨｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｏｎ－ｎｏｒｍａｌｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｄａｔａｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓａｎｄｗｉｔｈｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌｄａｔａｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄｔｈｅＰｅａｒｓｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＭＡＰ
，
ＭＳＡＰ，ａｎｄＳＡＰｇｒｏｕｐｓｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＥＭＰｓ（ａｌｌＰ＜０．０５）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＭＡＰａｎｄＭＳＡＰｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅＳＡＰｇｒｏｕｐｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＥＭＰｓ（ｂｏｔｈＰ＜０．０５）．ＩｎｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＡＰ，ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＥＭＰｓｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＡｃｕｔｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＣｈｒｏｎｉｃＨｅａｌｔｈＥｖａｌｕａｔｉｏｎⅡｓｃｏｒｅ，ＢｅｄｓｉｄｅＩｎｄｅｘｆｏｒＳｅｖｅｒｉｔｙｉｎＡｃｕｔｅＰａｎｃｒｅ
ａｔｉｔｉｓ，Ｒａｎｓｏｎｓｃｏｒｅ，ＣＴｓｃｏｒｅ，ａｎｄＣ－ｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ（ｒ＝０．６８６２，０．７７７３，０．７１３８，０．７７１８，ａｎｄ０．４７３９，ａｌｌＰ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＭＡＰ，ＭＳＡＰ，ａｎｄＳＡＰｇｒｏｕｐｓｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＥＴ－１，ｖＷＦ，ａｎｄＶＣＡＭ－１ａｎｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＮＯ（ａｌｌＰ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＭＳＡＰａｎｄＳＡＰｇｒｏｕｐｓｈａｄｔｈｅｐｌａｓｍａｔｈａｔｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｏｆａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆＥＭＰｓ（ｂｏｔｈＰ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ａｌｌｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ，ｅｘｃｅｐｔｔｈｅＭＡＰｇｒｏｕｐｉｎｔｅｒｍｓｏｆＶＣＡＭ－１ａｎｄ
ｅＮＯＳ，ｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｎｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｅＮＯＳ，ｉＮＯＳ，ＩＣＡＭ－１，Ｐ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，ＶＣＡＭ－１，ａｎｄＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅ（ａｌｌＰ＜０．０５）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＨＣｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＭＡＰ，ＭＳＡＰ，ａｎｄＳＡＰｇｒｏｕｐｓａｎｄｔｈｅＬＰＳｇｒｏｕｐｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌ
ｏｆＲＯＳａｎｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅｄｕｃｔｉｏｎｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎＨＵＶＥＣｓ（ａｌｌＰ＜０ ０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｒｅｉｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎ ｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅｐｌａｓｍａｌｅｖｅｌｏｆＥＭＰｓｉｎＡＰｐａｔｉｅｎｔｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｖｅｒｉｔｙｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｐｌａｓｍａｏｆＡＰｐａ ｔｉｅｎｔｓｃａｎｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＥＭＰｓｉｎＨＵＶＥＣｓｉｎｖｉｔｒｏ，ｗｈｉｃｈｍａｙｂｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｅｌｌｏｘｉｄａｔｉｖｅｉｎｊｕｒｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ；ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ
急性胰腺炎（ａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ＡＰ）是消化内科常见的急腹症，约２０％的患者可发展为重症急性胰腺炎（ｓｅ
ｖｅｒｅａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ＳＡＰ），引起严重的全身炎症反应综合征，ＳＡＰ病死率高达３０％，但其发病机制尚未完全阐
明［１－２］。大量研究将ＡＰ的发病机制归因于胰酶激活和胰腺自身消化，继发免疫介导损伤和胰
腺微循环障碍［３］。研究［４］表明，血管内皮细胞功能损伤可能是ＡＰ微循环障碍的核心机制之一。近年来，高脂血症导致的
南湖中园小学ＡＰ发病率逐年增加，其中三酰甘油代谢产生的游离脂肪酸和乳糜微粒引起胰腺毛细血管阻塞并诱发胰腺微循环
障碍，游离脂肪酸通过刺激炎症介质合成，抑制线粒体功能，损伤胰腺血管内皮细胞和腺泡细胞，导致胰腺炎的发生［５］。因此，内皮细胞功能改变在ＡＰ发病过程中具有重要作用。
内皮细胞微粒（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＥＭＰ）是内皮细胞受到各种刺激时释放直径为０．１～１μｍ的微囊泡，内含大量ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、脂质和蛋白质等，作为细胞间转移炎症信号物质的载体，是近年来内皮细胞功能研究的热点［６］。研究［７－１０］表明系统性红斑狼疮、慢性肾脏病、急性冠状动脉综合征、糖尿病等患者中ＥＭＰ水平均明显升高，同时ＥＭＰ通过加重机体的血管内皮细胞损伤，促进组织炎症反应过程。但是在胰腺炎的发病过程中机体ＥＭＰ的水平变化尚不清楚。因此，本研究通过检测不同严重程度ＡＰ患者血浆中ＥＭＰ水平，以及通过体外实验观察ＡＰ患者血浆刺激ＥＭＰ形成的初步机制，探讨ＥＭＰ在ＡＰ患者发病机制中的可能作用。
１ 资料与方法
１．１ 研究对象 收集本院２０２０年８月—２０２１年６月６０例ＡＰ住院患者的血液标本，分为轻症急性胰腺炎（ｍｉｌｄ
ａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ＭＡＰ）组（ｎ＝２３）、中度重症急性胰腺炎（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，ＭＳＡＰ）组（ｎ＝２３）和
重症急性胰腺炎（ＳＡＰ）组（ｎ＝１４）。ＡＰ诊断标准参考２０１２亚特兰大分类新标准共识［１１］，并选取２０例健康体检者作为对照组。中美贸易额
１．２ 材料与仪器 人脐静脉血管内皮细胞（ｈｕｍａｎｕｍ
丢番图ｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＨＵＶＥＣ）购自美国ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ公司；ＢＩ血清购自以列生物科技公司；ＰＢＳ、ＲＰＭＩ－
１６４０培养基购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；青霉素－链霉素混合液、０．２５％胰蛋白酶购自北京索莱宝生物科技有限公
司；ＬＰＳ购自美国ｓｉｇｍａ公司（Ｂ５－Ｌ２８８０）；内皮素（ｅｎｄｏ ｔｈｅｌｉｎ１，ＥＴ－１）、血管性血友病因子（ｖｏｎｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃ
ｔｏｒ，ｖＷＦ）、一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）、血管内皮细胞黏附分子１（ＶＣＡＭ－１）ＥＬＩＳＡ试剂盒均购自武汉新启迪生
物科技有限公司；ＣＣＫ－８试剂盒购自ｂｉｏｓｈａｒｐ公司；ＲＴ－ＰＣＲ反转录试剂盒、荧光定量ＰＣＲ试剂盒购自日本
Ｔａｋａｒａ公司；ＧＡＰＤＨ引物、内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）、诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）、细胞间黏附分
子－１（ＩＣＡＭ－１）、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶及Ｐ－选择素引物由上海生工生物工程股份有限公司设计与合成；
ＡＢＩＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ＦｌｅｘｑＲＴ－ＰＣＲ仪（赛默飞世尔科技有限公司）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔｓ（型号３４１３，美国康宁公司）；
ＣＤ３１ＡＰＣ、ＣＤ４１ＰＥ（美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司）；Ｆｌｏｗ－Ｃｏｕｎｔ
Ｆｌｕｏｒｓｐｈｅｒｅｓ（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；ＣｙｔｏＦＬＥＸ分析流式细胞仪（美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）；多功能酶标仪（美国
ＰＥ公司）。
１．３ 研究方法
１．３．１ ＥＭＰ分离 收集患者入院后（２４ｈ内）次日晨血
５ｍＬ于柠檬酸钠抗凝管中，采用差速离心法，以１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ获取富血小板血浆，再以４０００ｒ／ｍｉｎ离心
３０ｍｉｎ，获取贫血小板血浆（ＰＰＰ），于－８０℃保存［６］。１．３．２ ＥＭＰ检测 将ＰＰＰ解冻，取５０μＬＰＰＰ，加入５μＬＣＤ３１－ＡＰＣ、５μＬＣＤ４１－ＰＥ充分混合，室温下避光孵育
３０ｍｉｎ，再加入４００μＬＢｉｎｄｂｕｆｆｅｒ、４０μＬＦｌｏｗ－ＣｏｕｎｔＴＭ荧光计数微球充分混合，采用流式细胞仪检测ＥＭＰ，使用
５μＬ兔抗人ＰＥ－ＩｇＧ１及５μＬＰＥ－ＩｇＧ１作为对照。
ＣＤ３１－ＡＰＣ阳性及ＣＤ４１－ＰＥ阴性为ＥＭＰ，根据荧光计数微球计算ＥＭＰ水平。
１．３．３ 内皮细胞功能相关因子检测 ＡＰ患者血浆中
ＥＴ－１、ｖＷＦ、ＮＯ、ＶＣＡＭ－１水平，按照ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书进行检测。
１．３．４ ＨＵＶＥＣ细胞培养和实验分组 ＨＵＶＥＣ细胞复苏，培养于３７℃、５％ＣＯ２的细胞培养箱中，使用１０％ＢＩ
血清、１％青霉素－链霉素溶液进行培养，根据细胞生长状况２～３ｄ更换１次培养基，显微镜下观察细胞汇合程度达到８０％时，用０．２５％的胰蛋白酶消化细胞，重悬细胞并计数，以５×１０４个／孔的密度接种于２４孔（０．４μｍ）的Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔｓ中。将接种于Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔｓ中的ＨＵＶＥＣ细胞，培养２４ｈ，饥饿处理１２ｈ后，另各取ＭＡＰ、
ＭＳＡＰ、ＳＡＰ患者的ＰＰＰ，采用超速离心法（１０００００×ｇ）４℃离心２ｈ以去除ＡＰ患者血浆中的ＥＭＰ［１２］，取上清，分别
加入到Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的下室，与上室的ＨＵＶＥＣ共培养６ｈ，
１０μｇ／ｍＬ的ＬＰＳ作为阳性对照组，ＣＣＫ－８法检测ＨＵＶＥＣ细胞活力。
１．３．５ ＨＵＶＥＣ上清液中ＥＭＰ检测 收集Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔｓ中上室的细胞培养液，再以４０００ｒ／ｍｉｎ离心
３０ｍｉｎ，流式细胞仪检测方法同ＡＰ患者血浆中ＥＭＰ的检测。
１．３．６ ＨＵＶＥＣ中ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶及Ｐ－选择素的ｍＲＮＡ表达水平 用Ｔｒ ｉｚｏｌ提取Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔｓ中ＨＵＶＥＣ细胞的总ＲＮＡ，用Ｔａｋａｒａ公司的逆转录试剂盒将ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ，采用
ＱｕａｎｔｉＮｏｖａＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲ试剂盒进行定量ＰＣＲ反应，反应条件为９５℃、２ｍｉｎ１个循环；９５℃、５ｓ，６０℃、１５ｓ，
７２℃、２０ｓ共４０个循环。所用ｑＲＴ－ＰＣＲ引物序列见表１。用２－ΔΔＣｔ方法计算ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶及Ｐ－选择素的ｍＲＮＡ的相对表达量。
１．３．７ ＤＣＦＨ－ＤＡ法检测ＨＵＶＥＣ中的细胞活性氧（ＲＯＳ）含量 收集Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔｓ中ＨＵＶＥＣ，５００×ｇ离
心５ｍｉｎ，加入１ｍＬ无血清培养液稀释的终浓度为
１０μｍｏｌ／Ｌ的ＤＣＦＨ－ＤＡ，３７℃孵育２０ｍｉｎ；用无血清培养液洗涤细胞３次，５００×ｇ离心５ｍｉｎ，重悬于４００μＬ无
血清培养液，立即采用流式细胞仪检测。
１．３．８ ＪＣ－１染法检测ＨＵＶＥＣ的线粒体膜电位 收集Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔｓ中ＨＵＶＥＣ，ＰＢＳ洗涤细胞，５００×ｇ离
心５ｍｉｎ，分别加入１ｍＬ细胞培养液和１ｍＬＪＣ－１染工作液，混匀，３７℃孵育２０ｍｉｎ；用ＪＣ－１染缓冲液（１×）洗涤２次，５００×ｇ离心５ｍｉｎ，重悬于４００μＬ细胞培养液，立即采用流式细胞仪检测。
表１ ｑＲＴ－ＰＣＲ引物序列
Ｔａｂｌｅ１ ＰｒｉｍｅｒｓｏｆｑＲＴ－ＰＣＲ
引物名称引物序列（５′－３′）
ＧＡＰＤＨＦ：ＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＣ
Ｒ：ＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＡＡ
ｅＮＯＳＦ：ＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴ
Ｒ：ＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＣＴ
ｉＮＯＳＦ：ＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＣＣＡＡＡＴＡＣＧＡ
Ｒ：ＧＴＣＧＴＡＧＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴ
ＩＣＡＭ－１Ｆ：ＣＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＧＣ
Ｒ：ＡＧＣＧＴＡＧＧＧＴＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＣ
ＶＣＡＭ－１Ｆ：ＡＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧ
Ｒ：ＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴ
ＮＡＤＰＨ氧化酶Ｆ：ＣＴＧＴＧＧＴＧＴＴＡＣＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣ
Ｒ：ＣＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡ
Ｐ－选择素Ｆ：ＣＴＧＴＴＡＣＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＡＴＧＧＧＣ
Ｒ：ＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧ
注：ＧＡＰＤＨ，内参。
１．４ 统计学方法 采用ＳＰＳＳ２２．０软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以ｘ±ｓ表示，多组间比较采用
方差分析，进一步两两比较采用ＬＳＤ－ｔ检验；不符合正态分布的计量资料以Ｍ（Ｐ２５～Ｐ７５）表示，组间和组内两两比较采用Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓＨ秩和检验。计数资料组间比较采用χ２检验。相关分析采用Ｐｅａｒｓｏｎ相关性检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ 一般资料 ６０例ＡＰ患者中胆源性２８例，高脂血症型２０例，混合型３例，酒精性１例，其他８例。各组
ＷＢＣ、中性粒细胞、ＣＲＰ、Ａｌｂ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＬＤＨ、ＢＵＮ、
ＣＲＥ、钾、钠、钙、血糖水平比较差异均有统计学意义（Ｐ值均＜０．０５）；与ＭＡＰ组比较，ＭＳＡＰ和ＳＡＰ组的
ＡＰＡＣＨＥⅡ评分、ＢＩＳＡＰ评分、Ｒａｎｓｏｎ评分、ＣＴ评分均有统计学差异（Ｐ值均＜０．０５）（表２）。
２．２ ＡＰ患者血浆中ＥＭＰ水平的检测 与对照组相比［（１８８．０９±１７．２０）个／μＬ］，ＭＡＰ组［（３６９．４１±１５６．７８）个／μＬ］、
ＭＳＡＰ组［（９９７．２９±１８６．２４）个／μＬ］、ＳＡＰ组［（１７６９．００±２７４ ６２）个／μＬ］ＥＭＰ水平明显升高（Ｐ值均＜０．０５）。与
ＭＡＰ组、ＭＳＡＰ组比较，ＳＡＰ组ＥＭＰ水平明显升高（Ｐ值均＜０．０５）（图１）。
２．３ 不同严重程度的ＡＰ患者血浆中ＥＭＰ水平与临床特征的关联分析 ＡＰ患者ＥＭＰ水平与ＡＰＡＣＨＥⅡ、
ＢＩＳＡＰ评分、Ｒａｎｓｏｎ评分、ＣＴ评分、ＣＲＰ均呈正相关（ｒ值分别为０．６８６２、０．７７７３、０．７１３８、０．７７１８、０．４７３９，
Ｐ值均＜０．０１）。
表２ ＡＰ患者临床资料
Ｔａｂｌｅ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌｄａｔａｏｆａｃｕｔｅｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓｐａｔｉｅｎｔｓ
指标对照组（ｎ＝２０）ＭＡＰ组（ｎ＝２３）ＭＳＡＰ组（ｎ＝２３）ＳＡＰ组（ｎ＝１４）统计值Ｐ值性别（例）χ２＝６．３４４０．０９６ 男１３１７９９
女７６１４５
年龄（岁）４６．１０±１７．１５４５．２２±１５．６１４５．００±１６．１３５０．９３±２１．４５Ｆ＝０．５１００．７４７ＷＢＣ（×１０９／Ｌ）５．９５±１．６６１２．５５±４．５４１）１５．１５±６．２４１）１２．９１±３．４７１）Ｆ＝１６．２２０＜０．０１中性粒细胞（×１０９／Ｌ）３．３５±０．９７１０．６６±４．３０１）１２．９９±５．３４１）１１．３９±３．５０１）Ｆ＝２３．３５０＜０．０１ＲＢＣ（×１０１２／Ｌ）４．５１±０．３６４．８７±０．６３１）４．６４±０．７９４．６６±０．８８Ｆ＝１．０５６０．３７０ＨＢ（ｇ／Ｌ）１３５．００（１２４．５０～１４５．２５）１４９．００（１３１．００～１６４．００）１）１４０．００（１２０．００～１５８．００）１３８．５０（１２５．７５～１７２．２５）Ｈ＝５．９２９０．１１５ＨＣＴ（％）４０．１２±４．３４４３．３３±５．１６１）４０．６２±６．２６４２．０１±８．５４Ｆ＝１．２６１０．２９４ＣＲＰ（ｍｇ／Ｌ）０．５３（０．４３～０．６５）２１．８８（６．０１～１２１．２７）１）６０．３１（５．８２～１９６．１９）１）１４１．２８（４４．１９～２５２．８３）１）Ｈ＝４６．０７０＜０．０１Ａｌｂ（ｇ／Ｌ）４２．４８±２．８７４２．８９±５．４５ ４０．６８±５．５０３４．１０±６．８３１）Ｆ
＝９．５２０＜０．０１ＴＢｉｌ（μｍｏｌ／Ｌ）１３．５５（９．６６～１５．５８）１５．８５（１０．８９～２２．８５）１７．５０（１１．９４～３６．１７）１）２５．０８（１２．８３～３３．３２）１）Ｈ＝７．３４８０．０６２ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）１５．５０（１０．２５～２５．２５）４３．００（３３．００～７０．００）１）３７．００（１９．００～２６４．００）１）３０．５０（１９．７５～４５．５０）１）Ｈ＝１９．５２９＜０．０１ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）１７．００（１５．２５～２０．００）２６．００（２２．００～５３．００）１）４１．００（２３．００～１１６．００）１）３８．５０（２５．２５～７８．２５）１）Ｈ＝２６．０６７＜０．０１ＡＬＰ（Ｕ／Ｌ）８１．００（６８．００～９７．７５）１０２．００（８７．００～１３７．００）１）１０１．００（８４．００～１４１．００）１）９０．５０（７６．２５～９７．７５）Ｈ＝１２．６６７＜０．０１ＬＤＨ（Ｕ／Ｌ）１６１．００（１４８．００～１７４．００）２０７．００（１７７．００～２４４．００）１）２４７．００（１８３．４０～３２３．００）１）５２１．５０（２２０．００～７３３．２５）１）Ｈ＝４８．４７５＜０．０１ＢＵＮ（μｍｏｌ／Ｌ）５．１８±１．２８５．５５±１．３６４．５６±２．０２７．０５±２．９９１）Ｆ＝５．０５４０．００３ＣＲＥ（μｍｏｌ／Ｌ）６６．０４±９．９４ ５９．８０±１８．９０５４．６４±２７．０７８６．０８±５８．２３Ｆ＝３．３７２０．０２３钾（ｍｍｏｌ／Ｌ）３．９３±０．３３４．２８±０．４２１）３．８０±０．３１４．０８±０．９０Ｆ＝３．６３５０．０１７钠（ｍｍｏｌ／Ｌ）１４０．９５（１３９．４０～１４２．１８）１３６．２０（１３４．１
０～１３８．４０）１）１３６．６０（１３１．８０～１３８．５０）１）１３６．５０（１３１．１８～１４０．５５）１）Ｈ＝２４．１７９＜０．０１钙（ｍｍｏｌ／Ｌ）２．３０（２．２３～２．４０）２．３２（２．１９～２．４５）２．１４（２．０３～２．２３）１）１．７８（１．１４～２．１０）１）Ｈ＝３０．５２５＜０．０１血糖（ｍｍｏｌ／Ｌ）４．８３（４．５３～５．１８）７．４２（６．３３～１３．１６）１）８．１８（７．０７～９．７６）１）８．９９（６．６３～１１．５６）１）Ｈ＝３１．０６１＜０．０１ＡＰＡＣＨＥ－Ⅱ评分≥３［例（％）］１６（６９．６）２１（９１．３）１４（１００．０）χ２＝７．４８５＜０．０５ＢＩＳＡＰ评分≥３［例（％）］０１（４．３）１０（７１．４）χ２＝３４．５２８＜０．０５Ｒａｎｓｏｎ评分≥３［例（％）］０１２（５２．２）１２（８５．７）χ２＝２８．９４４＜０．０５ＣＴ评分＞３［例（％）］５（２１．７）１３（５６．５）１４（１００．０）χ２＝２１．５６８＜０．０５ 注：与对照组比较，１）Ｐ＜０．０５。
２．４ ＡＰ患者血浆中ＥＴ－１、ｖＷＦ、ＮＯ、ＶＣＡＭ－１水平的
检测 与对照组相比，ＭＡＰ组、ＭＳＡＰ组、ＳＡＰ组的
太原空气源热泵设计ＥＴ－１、ｖＷＦ、ＶＣＡＭ－１水平明显升高，ＮＯ水平明显降低
（Ｐ值均＜０．０５）（图２）。
２．５ ＡＰ患者血浆对ＨＵＶＥＣ中ＥＭＰ合成水平的影响 与
对照组相比，ＭＡＰ组患者血浆对ＨＵＶＥＣ中ＥＭＰ水平影响
不大（Ｐ＞０．０５），ＭＳＡＰ和ＳＡＰ组血浆可促进ＨＵＶＥＣ中ＥＭＰ
大量释放（Ｐ值均＜０．０５），提示ＡＰ患者血浆中含有致内皮
细胞损伤炎性介质，加重ＨＵＶＥＣ损伤和ＥＭＰ生成（图３）。
２．６ ＡＰ患者血浆对ＨＵＶＥＣ中ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ－１、
Ｐ－选择素、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶的ｍＲＮＡ表达水
平的影响 用１０μｇ／ｍＬ的ＬＰＳ作阳性对照，分别用正常
人的血浆和不同严重程度ＡＰ患者的血浆刺激ＨＵＶＥＣ
６ｈ，ＣＣＫ－８检测提示ＨＵＶＥＣ活力为７６．９０％。ｅＮＯＳ、
ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶及Ｐ－选择素的ｍＲＮＡ表达水平均增加，与对照组比较，除ＭＡＰ组的
ＶＣＡＭ－１和ｅＮＯＳ外，其余各组的ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ＩＣＡＭ－１、
Ｐ－选择素、ＶＣＡＭ－１、ＮＡＤＰＨ氧化酶的ｍＲＮＡ表达水平均显著升高（Ｐ值均＜０．０５）（图４）。注：Ｐ１，ＥＭＰ所在区域；Ｐ２，藻红蛋白（ＰＥ）和别藻蓝蛋白（ＡＰＣ）双阳性区域；Ｐ３，阴性颗粒所在区域；Ｐ４，藻红蛋白（ＰＥ）阳性区域。
图１ 不同严重程度ＡＰ患者的ＥＭＰ水平检测
Ｆｉｇｕｒｅ１ ＥＭＰｌｅｖｅｌｏｆＡＰｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｖｅｒｉｔｙ
图２ ＡＰ患者血浆中ＥＴ－１、ｖＷＦ、ＮＯ、ＶＣＡＭ－１水平改变Ｆｉｇｕｒｅ２ ＰｌａｓｍａｌｅｖｅｌｓｏｆＥＴ－１、ｖＷＦ、ＮＯａｎｄＶＣＡＭ－１
ｉｎＡＰｐａｔｉｅｎｔｓ
２．７ ＡＰ患者血浆对ＨＵＶＥＣ中ＲＯＳ水平的影响 与对照组ＲＯＳ水平（４．５７％±０．１９％）相比，ＭＡＰ组（５ ７０％±
０ ３８％）、ＭＳＡＰ组（７．４０％±０．１０％）、ＳＡＰ组（１２ ９５％±
０ ２６％）、ＬＰＳ组（６３．００％±０．５５％）患者ＨＵＶＥＣ中的ＲＯＳ水平均升高明显（Ｐ值均＜０．０５）。
２．８ ＡＰ患者血浆对ＨＵＶＥＣ中线粒体膜电位的影响 与对照组线粒体膜电位下降率（０．５４％±０．３９％）相比，
ＭＡＰ组（２．２４％±０．３０％）、ＭＳＡＰ组（７．４８％±２．４９％）、ＳＡＰ组（１２．９０％±１．６１％）、ＬＰＳ组（６３．１７％±１．６５％）ＨＵＶＥＣ中的线粒体膜电位下降更明显（Ｐ值均＜０．０５）。３ 讨论
ＡＰ发生过程中，胰腺微血管在组胺、白三烯、缓激肽等炎症介质的作用下促进血管内皮细胞收缩，同时ＩＬ－
１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１８、ＴＮＦα等细胞因子通过内皮细胞骨架的重构，导致血管内皮通透性增加，胰腺微循环血管屏障
受到破坏［１３］。另一方面血管内皮细胞活化或受到刺激时ＥＭＰ释放增加。ＥＭＰ是一种内皮功能障碍的血浆标志物，由内皮细胞在激活、损伤或凋亡时释放，可将大量的生物活性分子，如生长因子、蛋白酶、黏附分子、ＤＮＡ和
ｍｉｃｒｏＲＮＡ转移到受体细胞，加重炎症损伤［１４］。因此胰腺微血管内皮细胞结构及功能受损是ＡＰ过程中的重要
发病机制。
ＥＭＰ水平升高是炎症性疾病的临床特征，Ｐａｒｋｅｒ等［７］研究表明系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）与内皮细胞损伤和
功能障碍有关，活动性ＳＬＥ患者ＥＭＰ水平明显升高，降低ＥＭＰ水平有助于改善ＳＬＥ患者的心血管风险，改善炎症疾病活动度同时可改善ＥＭＰ水平，表明抑制炎症是影响ＥＭＰ变化的关键因素。Ｐｅｒｎｏｍｉａｎ等［１５］研究表明糖尿病患者高血糖通过氧化应激反应，促使ＥＭＰ释放增加，诱导促炎途径并发心血管功能障碍，导致心血管事件的发生，表明ＥＭＰ在糖尿病疾病发展过程中起到关键作用。本研究采用ＣＤ３１、ＣＤ４１检测ＥＭＰ［定义ＣＤ３１（＋）
ＣＤ４１（－）为ＥＭＰ］，结果发现，ＡＰ患者ＥＭＰ水平升高，且ＳＡＰ组患者的ＥＭＰ水平明显高于ＭＡＰ组和ＭＳＡＰ组，
ＥＭＰ水平与疾病的严重程度呈正相关，表明ＥＭＰ可作为评估ＡＰ炎症程度的生物学指标。
注：Ｑ２－ＵＬ，ＥＭＰ所在区域；Ｑ２－ＵＲ，藻红蛋白（ＰＥ）和别藻蓝蛋白（ＡＰＣ）双阳性
区域；Ｑ２－ＬＬ，阴性颗粒所在区域；Ｑ２－ＬＲ，藻红蛋白（ＰＥ）阳性区域。
图３ ＡＰ患者血浆对ＨＵＶＥＣ中ＥＭＰ水平的影响
Ｆｉｇｕｒｅ３ ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｐｌａｓｍａｏｎＥＭＰｌｅｖｅｌｉｎＨＵＶＥＣｏｆＡＰｐａｔｉｅｎｔｓ
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