• 536 •国际呼吸杂志2021 年4 月第41 卷第7 期Int J Respir，April 2021,V o U l，No.7
王敏毛明清李男加慧夏书月
沈阳医学院附属中心医院呼吸内科110024
通信作者：夏书月，Em ail:syx262@126
【摘要】外泌体是直径为40〜100 n m的囊泡样小体，能通过与靶细胞的细胞膜融合、胞 吞作用等方式将其携带的微小RNA (m iR N A)、蛋白质等传递至靶细胞中，介导细胞间的信息
春天的童话交流并调控细胞的生理功能。近年来研究发现，外泌体m iR N A在慢性阻塞性肺疾病（COPD)
的发生、发展及诊断中具有重要作用，有望为C O P D的诊断和提供新的思路。文章结合国
内外研究现状，对外泌体m iR N A在C O P D中的作用进行综述。
【关键词】外泌体；肺疾病，慢性阻塞性；微小RNA
基金项目：辽宁省科学技术计划项目（L N C C C-D14-2015)；沈阳市科学技术计划项目（17-
230-9-05)；沈阳市科学技术计划项目（20-205-4-073)
D O I： 10.3760/c m a.j.c n l31368-20200810-00713
Research progress of miRNA and exosomes in chronic obstructive pulmonary disease
Wang M in, Mao M in gqin g, L i N an, J i a H u i, X ia Shuyue
Department o f R espirato ry M edicine, the Center H ospital A ffilia te d to Sh en yang M edical
C ollege, Shenyang 110024, China
C orresponding author ： X ia Shuyue, E m a il: sy x262@ 126. com
【Abstract! Exosomes are sorts of small extracellular vevsicles ranging approximately from
40 nm to 100 nm in diameter, which can serve as carriers transporting microRNA (m iR N A),
protein and others to target cells by means of cell membrane fusion and cell swallowing, further
mediating cell communication and regulating cell physiological function. In recent years, the related
researches have found that ex〇v S〇mal miRNA plays a role in the occurrence, development and clinical
diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease (C O PD), which is expected to provide new ideas
for the diagnosis and treatment of COPD. In this review, the role of exosomal miRNA in COPD will
be introduced based on domestic and overseas research status.
【Key words】Exosomes; Pulmonary disease, chronic obstructive; MicroRNA
Fund program：Liaoning Province Science and Technology Project ( LNCCC-D14-2015 );
Shenyang Science and Technology Project (17-230-9-05) ；Shenyang Science and Technology Project
(20-205-4-073)
D O I： 10.3760/c m a.j.c n l31368-20200810-00713
C O P D是一种具有气流受限特征的慢性气道炎症性疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，其发病与肺部对有害气体或有害颗粒尤其是吸烟引起的异常炎症反应有关[1]。据估计，目前全世界有超过3亿人受到C O P D的影 响.到2020年，全世界有6 800万人死亡，其中470万人死于该病[2]。现今外泌体越来越被认为是细胞间通讯、免 疫调节、疾病诊断和预后循环生物学标志物的重要载体3’。许多研究报道，肺疾病患者的外泌体m iR N A谱与健康人不同，因此外泌体m i R N A似乎有潜力成为肺部疾病的非侵入性诊断生物标志物和耙点。本文将介绍外泌体m iR N A的概念及基本实验方法，并总结外泌体m iR N A在 C O P D的发生、发展中的作用。
1外泌体m iRN A及其提取方法
1.1外泌体及外泌体m i R N A细胞可释放具有膜结构的多种小囊泡到胞外，这些细胞外囊泡有不同的亚，可根 据其生物发生和分泌机制的不同而分为外泌体•微囊泡和凋亡小体，其中外泌体是目前研究最热的亚'7]。外泌体是指包含了复杂R N A和蛋白质的小膜泡（30〜150 n m), 现今其特指直径在40〜100 n m的盘状邋泡w。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内
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溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中™。近年来，外泌体及其m iR N A在肿瘤、心血管、肝、肺、肾、血液系统疾病等领域的诊断、预后和方面显示出良好的研究背景，且外泌体m iR N A也极有潜力成为人类重大疾病的新型分子标志物和靶标…1 - m iR N A是一类长度约19〜24 n t的非 编码单链R N A，通过碱基互补配对的方式与靶基因的
3~U T R区部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而起到转录后调控靶基因表达的作用[|1]。m iR N A广泛存在于动物、植物、真菌及病毒的基因中，调控生物体生长发育和疾病发生等过程中相关基因的表达。m i R N A的异常表达可能会导致生理状态的异常和疾病的发生，在多种癌症中，m i R N A的表达水平会明显改变，有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用[12：|。在呼吸系统疾病中，m i R N A表达谱的临床研究也有望促进炎症性呼吸疾病的诊疗进展。 1.2 外泌体m i R N A的提取、分离及检测同一miRNA 受不同提取方法的影响，在外泌体中检出水平有所不同，不同方法影响R N A片段分布和m i R N A表达，未影响m iR N A相对表达趋势。黄依瑶等[u]通过采用超高速离心法+T r i z o l LS 法、ExoQuick +SeraM ir、TEI +T ER与 E xoRN easy试剂盒提取方法分离3例血清中外泌体总RNA (e x o-R N A)，分析R N A片段分布，检测m i R N A表达水平，结果表明E x o R N e a sy试剂盒仅需一步提取血清中
e x o-R N A，且提取R N A条带浓度较高，各m iR N A表达水平较高，适用于大规模提取血清标本进
行后续rm R N A测 序和q P C R等实验。人体内的循环m iR N A之所以可以在外周血中稳定存在而免于血液中核糖核酸酶的降解，是因为m iR N A被微泡、外泌体等囊泡包裹，或者与蛋白质结合形成复合物，循环m i R N A常规的提取方法是首先裂解包裹m iR N A的膜结构，再提取释放人血清的游离m iR N A，但 m iR N A释放人血液必定遭受各种干扰因素的降解.性质极不稳定，影响提取效率。针对以上问题.有研究提出首先从血清中分离出外泌体，使m i R N A在被提取之前就已经随外泌体脱离血清了，从而大大增加了提取效率:H]。目前 检测外泌体内m i R N A的表达量的常用方法有Northern B lot标准检测方法、实时定量P C R检测、微阵列芯片检测和大规模测序。目前许多m i R N A生物传感方法需要繁琐的样本处理过程，包括提取总R N A，在很大程度上限制了它们在生物医学和临床研究中的应用。R am shani等[15]提 出了一种简单、快速、无P C R的集成微流体平台，该平台集成表面声波裂解微流控芯片、浓度传感微流控芯片和给予非平衡离子电流的动膜传感器，能够对血浆中自由漂浮的m iR N A s和外泌体包含的m i R N A s进行绝对定量（< 10%的不确定性），具有1p m的检测敏感度，与传统的R T-q P C R方法不同，该技术不需要外泌体的提取、RNA 纯化、逆转录或扩增。该平台实验时间只有30 min，样本量只需20 m l，大大减少了传统R T-q P C R技术的耗时耗量。同样，〇!〇等[16]研究团队开发了一个集成的微流控指数滚动循环放大平台，用于直接在微加工样品中检测
m iR N A s的敏感度和特异度，此方法的高敏感度立即解决
了样本消耗方面的挑战。因此微流控芯片技术将为促进
m iR N A分析在生物学和临床中的应用提供一个有用的平台。
2 miRNA 与COPD
2.1 m iR N A与吸烟高危因素C O P D的发病机制主要是
慢性炎症反应、蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化抗氧化失衡
及气道重塑，吸烟是导致这种异常炎症反应的最主要的因素。越来越多的研究报道，烟草刺激和C O P D发病相关的
m iR N A的差异表达有关。H M io t等[17]研究发现香烟烟雾
提取物（cigarette smoke extract, CSE)等刺激不仅可以影
响细胞外囊泡的水平，还可以改变细胞外囊泡中特异性
m i R N A的表达。吸烟改变了人支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，B A L F)中存在的细胞外囊
泡的m iR N A谱，从而影响周围正常支气管上皮细胞的状态。通过对10名吸烟者和10名非吸烟者进行
了B A L F中 细胞外囊泡的分离，比较2组细胞外囊泡中存在的10种 m i R N A的数量，对其进行了统计分析，讨论了吸烟状态的生物学意义，并评估B A L F来源的细胞外囊泡中的miRNA 作为烟草暴露潜在生物标志物的价值。研究表明，肺细胞外囊泡的组成和作用实际上取决于吸烟状况，并且与烟草
暴露对肺细胞的早期有害作用有关。
尽管研究表明，吸烟影响肺中m i R N A的表达，并在
C O P D的发展中发挥重要作用，但其确切的影响机制仍需
进一步研究。在一项研究中，与没有气流受限的吸烟者相比，C O P D患者的外周血单个核细胞有8种miRNAs (miR-24-3p、miR-93-5p、miR-320a、miR-320b、miR-191-5p' let-7b-5p、miR-342-3p 和miR-92a-3p)上调以及 3 种 miRNAs (m iR-3613-3p、miR-1273g-3p 和miR-4668-5p) 下调U8]。m iR-24-3p在单核细胞中持续高表达，在吸烟者中，m iR-93-5p主要在单核细胞中表达，而在C O P D患者中，m iR-93-5p在CD4+T细胞、C D8+T细胞和单核细胞中均表达。此外，他们还显示，在C O P D患者中，C D8+T 细胞是m iR-320a和m iR-320b表达增加的主要细胞类型[18]。在非吸烟者与吸烟者的比较中，一些差异表达的m iR N A可能是由于吸烟者血液中存在不同的细胞类型（T 淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞），这些细胞释放的细胞外囊泡/外泌体富含本研究发现的特定rm RN A。
3111«1^等[19：1验证了一些源自C S E处理的人单核细胞(U937)的外泌体m i R N A，显示大多数m i R N A表达降低的趋势（miR-let-7a-5p、miR-let7i-5p、miR-103a-3p 和 miR-151b)。他们发现，与对照组比较，C S E处理的人类单核细胞（倾向于下调）和上皮细胞（倾向于上调）中，外泌体m iR N A表达的方向性有很大差异。这表明在体外C S E诱导的细胞应激过程中，外泌的表达差异
依赖的是不同的细胞类型。
3^1^11等[2°]发现香烟烟雾暴露能够提高人和小鼠血浆中的外泌体水平，以及原代人肺微血管内皮细胞上清液中的外泌体水平，香烟烟雾暴露也改变了内皮细胞外泌体的
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组成，增加了let-7d、miR-191、miR-126 和miR-125a 的表 达，内皮细胞外泌体将这些m i R N A传递给特化的巨噬细
胞会影响凋亡细胞的清除。有研究认为香烟烟雾诱导外泌
体中的m iR N A是具有选择性的，而不是非特异性的反应
细胞内的m iR N A的表达，并且这些靶向效应可能在吸烟
者内皮损伤和炎症相关疾病的发病机制中起重要作用，如 C O P D。以上探讨的外泌体m iR N A在吸烟所致C O P D中差 异表达的原因和作用，对于深人了解吸烟所致肺部疾病及
C O P D的分子机制，寻吸烟所致机体损害的早期生物标
志物和防治措施提供了有力的证据。
2.2外泌体m iR N A与C O P D发病机制C()P D是一种慢性异质性疾病，其特征是持续和过度炎症、气道重塑、气 流受限和肺功能加速下降。外泌体通过旁分泌方式作用于
支气管上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等邻近细胞.导
致黏液高分泌，成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，巨噬细胞活化等，最终发生气道重塑与肺气肿[2〃3]。1^诉3等[24] 研究，在C S E作用下，原代人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells, H BECs)衍生的细胞外囊泡可诱导原代成纤维细胞分化成肌成纤维细胞。经验证得到，吸 烟导致的H B E C s细胞外囊泡中的miR-210表达上调是导致肺成纤维细胞中这种表型改变的原因，并且在肺成纤维细胞中，m iR-210通过下调A T G7负调控自噬过程来参与m iR-210介导的成纤维细胞分化。同时F u jita等《5：1研究得出.在肺成纤维细胞中，L C3和A T G5基因敲除的自噬抑制能够诱导a-平滑肌肌动蛋白和I型胶原表达水平增加，并增强肌成纤维细胞的分化。高璇等「26]认为，自噬是一个动态的生
物过程，在过程中某些产物的增多并不够证明整个自噬过程是高水平进行的，在C O P D患者及模型中观察到的自噬标记物的过表达正是自噬这一动态过程在某一节点被阻断，从而造成自噬中间产物堆积的表现，而延缓C O P D的进展需将被阻断的自噬过程继续进行，以清除侵人肺细胞的病原体、代谢废物等，维持细胞内稳态。Li 等[27]研究得出，外泌体m iR-21在C S E处理的H B E C s中也可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，其作用机制是通过促进低氧诱导因子l a的表达而下调VonHippel- L m d a u蛋白，从而增加了胶原蛋白和a-平滑肌肌动蛋白的水平。这些机制结合肌成纤维细胞分化在气道重塑中的作用可能为C O P D的诊断和提供新的线索。
W a n g等[2#1研究指出，miR-34可能抑制C D80和CD86 的表达和干扰素a的分泌，进而导致C O P D患者中的树突状细胞功能障碍，同时m iR-34c也被报道通过调节其耙基因H N F4和S E R P I N E1，与C O P D患者的肺气肿严重程度密切相关[29]。G u p ta等[31|]研究表明气道支气管上皮细胞之间的外泌体m iR-34a/b/C参与调节气道炎症和纤维化过程。S e rb a n等[zu：提及香烟烟雾暴露使C O P D患者内皮细胞外泌体来源的m iR-125a上调，但未阐明具体机制。王锐英[31] 通过高通量测序发现m iR-125a-5p在COPI)中表达水平增高，m iR-125a-5p的升高促进了C O P D中的巨噬细胞向M2 型转变，抗炎作用增加，分泌的促炎因子包括rmR-125a-5p 的靶基因IL-16表达下调，从而推测miR-125a-5p在C()PD 中可能发挥抗炎作用，是C O P D的保护因子，为C()P D提 供新的靶点。此类报道证明了外泌体m iR N A s调节炎
高效液相谱法原理
症过程影响C O P D病程，反映了m iR N A s、炎症调节及
C O P D间的密切联系。
2.3外泌体m i R N A与C O P D急性加重急性加重是
C O P D症状加重的发作，常与呼吸道感染同时发生。此外，病情加重会增加患者病情恶化的倾向.病情加重可能需要
住院，这会增加C O P D的病死率，这种有害疾病的发
展要求寻能够识别慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，A E C O P D)的生物标志物[32]。
乂丨6等[33]通过对41名健康对照者，40名无症状重度吸烟者和49例C O P I)患者的血清m iR N A进行分析后得出，无症状重度吸烟者和C O P D患者的血清miR-21和 miR-181a水平明显高于健康对照组。他们认为，血清miR-21和m iR-181a水平及其比值对预测重度无症状期
C O P D的发展具有潜在的生物标志物应用价值。X u等[34] 证实，m iR-21在吸烟者和吸烟的C O P D患者外泌体中过表达，且m i R-21水平与第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume at the first se
cond, FEV! ) ./FVC 呈正相关。由于血浆中m i R N A的差异变化.测量外泌体miRNA 并不等同于测量miRNA[35]。以上数据表明，血清和血清外泌体的m iR-21水平相似，经X u等[3«验证得出，血清外 泌体m i R-21与FEV, /F V C之间的决定系数高于血清miR-21与F E V,/F V C之间的决定系数，提示血清外泌体miR-21与F E V1;/F V C之间存在可靠的相关性，有可能成为预测C O P D严重程度的生物标志物。
大卫波德维尔W a n g等[36]研究表明，长链非编码RNA P V T1通过与miR-146a的相互作用，协助C O P D的疾病管理和急性加重风险预测。经验证得到，miR-146在A E C O P D患者中的表达最低，其次是稳定的C O P D患者和健康对照者，它的预测使C O P D易感性降低，急性加重风险降低，同时，miR-146a与A E C O P D患者和稳定期C O P D患者的慢性阻塞性肺疾病全球倡议分期和炎症细胞因子水平呈负相关。S a to等[371进一步研究得出，C O P D患者的肺纤维细胞中miR-；U6a的表达水平降低，通过促进耙基因COX-2表达导致前列腺素2水平升高。前列腺素2是扩大化和自我循环诱导衰老以及C O P D成纤维细胞炎症的一个关键成分[38]。八1(^311如1'等[39]发现，来自树突状细胞的外泌体含有m i R-146a，它可以在体内免疫细胞之间转移，他们还证明.含有m iR-146a的外泌体降低了炎症基因的表达，参与 了急性肺损伤的发病机制。外泌体来源的m iR-146a是否参与C.OPD的发病机制及分级有待进一步研究，虽然目前没有报道证实其他的外泌体m i R N A与C()P D的严重程度有关，但外泌体m i R N A在炎症调节及C O P D发病机制中的作用越来越被重视。
2.4外泌体m i R N A与骨骼肌萎缩C O P D不仅是一种局限于呼吸道和肺部的疾病，还是一种可以累及肺外各器官
国际呼吸杂志2021 年4 月第41 卷第7 期Int J Respir，April 2021，V o U l，No.7• 539 •的全身疾病，特别是骨骼肌萎缩和功能障碍，是导致
C()P D患者生活质量下降和病死率增加的主要危险因
素「4()]。近年来许多研究发现，在运动受限的C O P D患者中，约40%的患者肺功能并没有严重受损，而表现为明显的骨骼肌萎缩或功能障碍[18]。C O P D患者在疾病进展中常伴有不明原因的体质量下降，导致其运动受限，特别是中重度患者普遍存在不同程度的外周骨骼肌萎缩，表现为肌力、耐力的下降及易疲劳。目前有研究认为，骨骼肌萎缩的机制可能与全身炎症反应及内分泌紊乱、缺氧和高碳酸血症、氧化应激、营养不良、废用性萎缩、使用类固醇药物等相关[41]。目前一致认为C O P D是一种全身多系统的炎性反应性疾病，C O P D患者骨骼肌萎缩的发生是由多因素诱导、多种分子生物学机制参与的复杂过程，各种细胞因子及蛋白通路并非单独起作用，可能在骨骼肌萎缩的机制中相互作用。目前骨骼肌萎缩的具体机制尚不明确，因此发现骨骼肌萎缩的非侵人性标志物，可能为C O P D防治提供新的策略。
D o n ald so n等[<2]证实C O P D患者血浆中特异性
m icroR N A表达减少与骨骼肌无力和肌纤维组成改变有关，具体来说，miR-1与无脂肪质量呈负相关，而miR-499水 平与力量和股四头肌I型纤维比例直接相关。不局限于肌肉起源的miR-16和miR-122在患者和对照组之间差异无统计学意义。在早期C O P D患者中，血浆miR-499与肌肉核因子icBP50相关，但与p65无关，而在较晚期C O P D患者 中，血浆炎性细胞因子与miR-206相关。因此，C O P D患 者血浆中肌肉特异性m iR N A有可能成为骨骼肌萎缩活检表型的候选生物标志物。B u rk e等[43]研究了在轻度至中度C O P D患者与健康对照组中B A L F和血清中外泌体miRNA 的表达差异，目的是研究这些已鉴定的m iR N A对骨骼肌的影响，结果显示C O P D血清中发现1个显著上调的m iR N A，在COPD B A L F中发现4个显著下调的m iR N A，并且他们利用in-silico分析，研究了这些失调的m iR N A对 基因表达的影响。这一发现涉及哺乳动物雷帕霉素复合物1信号通路的靶基因，包括基因S6K，骨骼肌消耗的关键调节因子。证实了外泌体m iR N A的新作用，它可能驱动C O P D患者的骨骼肌萎缩的发生。
3总结与展望
本文总结了近年来关于外泌体m iR N A的提取、分离和检测方法，以及外泌体m iR N A在C O P D发病进程中的作用，探索其作为生物标志物的潜力，以了解C O P D发病机制。特别是含有特定分子特征的外泌体，包括m iR N A，可能被临床用作诊断和C O P D的新生标志物。但其广泛应用于临床方面，仍面临许多困难，还需要对外泌体分离的方案进行优化和标准化，以减少由于技术问题造成
的变异。某些特定的m iR N A参与了C O P D的发病机制，并 能够通过胞外囊泡传递系统传递到疾病部位，影响慢性炎症进程[“_45]。它们可能成为C O P D的重要焦点，这将成为C O P D患者的福音。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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