核⼼概念
在梯度的HPLC⽅法中，分析完成后会有⼀段⽤梯度⽅法的初始流动相条件冲洗⾊谱柱来为下⼀针的分析做准备的时间，这段时间⼀般被称为再平衡时间（re-equilibration time）。在图1中可以看到流动相组成随着时间的变化，其中再平衡时间被标注为tre-eq。这个图中有⼏个重要的信息：第⼀，虽然流动相组成的变化（从φi变到φf）被设置成从⽅法启动时就开始了（实线部分），但是在柱⼊⼝流动相组成的变化有⼀个延迟时间td，也就是流动相从泵出⼝流到⾊谱柱⼊⼝的这段时间，这种延迟影响了从φi到φf的变化；第⼆，这种延迟也影响了从φf到φi的变化，从虚线的形状也可以看到流动相组成从φf 回到φi并没有像设置⼀样突然实现；另外，这种差异和泵系统的出⼝端和柱进⼝端之间的仪器部件（如混合器、连接头、定量环等）有关。了解这种差异对理解梯度洗脱时的⾊谱柱的再平衡是⾮常重要的。在图1中，我们可以看到实际上⽤梯度⽅法的初始流动相（φi）的再平衡在tflush后才发⽣。我们经常把tflush估算为两倍延迟时间（td），即： 其中Vd是梯度延迟体积，F是流速。传统的泵系统（如HP 1100和Alliance 2695）有1 mL左右的延迟体积，⽽现代的超⾼效液相⾊谱（UHPLC）有更⼩的延迟体积，⼀般100 µL左右。如果我们把⼀个分析⽅法的流速设置为0.5 mL/min 时，传统的泵系统的tflush⼤约是4 min，在现代的UHPLC系统中，这个时间
为0.4 min。同样的，进⼊柱⼊⼝的流动相不会马上达到初始流动相的组成φi，直到tflush之后我们才能认为已经开始⽤这个流动相来平衡柱⼦。
图1：梯度洗脱中使⽤的流动相程序（实线）以及在⾊谱柱⼊⼝段观测到的流动相组成（虚线）。两者的差异是由从溶剂混合处到柱⼊⼝之间的路径造成的。
再平衡对⾊谱柱来说意味着什么？
我们对梯度洗脱条件下⾊谱柱的平衡的研究最早来⾃21世纪初与Adam Schellinger以及Peter Carr教授在明尼苏达⼤学的⼯作。在发现洗脱时间的重要性之后，我们很快意识到我们需要区分两种不同程度的⾊谱柱再平衡：
•充分再平衡（Full re-equilibration）：这个名词指⾊谱柱达到⼀种⽆论怎么增加再平衡时间也不会影响接下来的梯度洗脱分析⽅法中分析物的保留时间的状态。换句话说，我们能认为这是⼀种⾊谱柱⽤初始流动相冲洗到真正平衡的状态。
•部分、可重现的再平衡（Partial, repeatable re-equilibration）：这个名词的意思是⾊谱柱虽然没有⽤初始流动相达到充分的平衡，但是这个再平衡时间可以保证分离过程中得到⾼度的可重现性。
了解这两种再平衡的区别⾮常重要，因为：1）达到充分的平衡会消耗⾮常长的时间（有些情况需要
数⼩时）；2）在很多情况下，获得⼀个有⽤的分析结果并不需要⾊谱柱的充分再平衡。在这些情况下，分析的⾼重现性（如⽤保留时间的准确度来衡量）⽐⾊谱柱的充分再平衡更重要，如果可以通过减少再平衡时间来缩短分析时间，那就能够显著提⾼分析通量、降低分析成本。
总结前⾯关于梯度⽅法时反相⾊谱柱的再平衡的⼤量详细的研究⼯作，我们可以得出以下两个结论：
•在tflush后的1-2个柱体积的平衡后有可能获得具有优秀重现性的梯度分析结果；
•充分的平衡过程会被⼏个因素影响，⽐如缓冲液的浓度、pH值，特别是对于离⼦型分析物。
第⼀个结论⾮常引⼈注意，因为当时主流的观点认为在梯度⽅法中需要⾄少⽤10个柱体积的起始流动相冲洗⾊谱柱。如果我们考虑到可以节约2-10个柱体积的冲洗时间，这就⾮常可观了。⽐如说，典型的150 x 4.6 mm的⾊谱柱的柱体积是1.5 mL，如果我们的流速是2 mL/min，那么当我们从原⽅法的10个柱体积减少8个柱体积时，我们每次进样可以节约6 min。金元外交
我们做的这些研究⼯作的出发点是更好地了解⼆维液相⾊谱（2D-LC）的平衡需要多少时间。这种进⼀步的了解确实促进了⼆维液相⾊谱的⼴泛使⽤，因为发现第⼆维的⾊谱柱的平衡仅仅需要数秒的时间，相当于仅使⽤起始流动相冲洗⼀个左右的柱体积。
环氧丙烯酸树脂HILIC分离的情况⼜会咋样呢？
在过去数年⾥，有很多关于HILIC柱再平衡速度的讨论。最近，David McCalley通过详实的实验来说明在梯度洗脱⽅法
在过去数年⾥，有很多关于HILIC柱再平衡速度的讨论。最近，David McCalley通过详实的实验来说明在梯度洗脱⽅法中HILIC分离的再平衡与反相分离相⽐没有那么⼤的差异。也就是说，HILIC分离的⾼重现性甚⾄可以在相对短的时间的再平衡后获得。然⽽，HILIC固定相的充分的再平衡需要花费⾮常长的时间（⽐如⼏⼗分钟或者⼏个⼩时）。McCalley 在这些研究中⽤过的最短的平衡时间是4.3 min。lgks200
我们最近实验发现在使⽤更短的再平衡时间时依然可以获得令⼈满意的HILIC分离结果。在我们的研究中，我们考察了再平衡时间对分析物的保留时间和保留重现性的影响，实验涉及到六款不同的固定相、三种不同的流动相pH、不同的缓冲液浓度以及中性和离⼦型化合物。在⼀些情况下，我们只需要⽤3秒的再平衡时间（在再平衡时间超过了实验中的tflush的前提下）。
会讲故事的⾊谱图
图2展⽰了我们在HILIC柱再平衡时的⼀系列⾊谱图。这⾥需要强调的是这些⾊谱图是通过⼀种⾮常规配置的仪器实现的，这种配置就是为了这个研究⽽专门设计的，它有两个特征：1）我们可以精确控制梯度分离之间的再平衡时间（可以到10 ms），2）梯度延迟体积很⼩（⼤约70 µL），但是最⼤流
速对于分析柱来说还是⾜够⼤（5 mL/min）。对这些细节感兴趣的读者朋友可以去阅读呈现这些结果的⽂献（参考⽂献10）。图2是平衡时间为0.3到15 min时所得到的⾊谱图，通过这些图谱我们看到再平衡时间的改变对保留时间的影响是⾮常⼩的，特别是平衡时间在2.5-15 min的范围内时。对于苯海拉明（diphenhydramine）（第⼆个峰）最明显的变化发⽣在当再平衡时间从0.63 min降低到0.30 min的时候。我们看到苯海拉明的保留时间在降低再平衡时间的时候保留时间会稍微延长，从⽽导致苯海拉明和苯甲酸（benzoic acid）的分离度会有轻微降低。很显然，了解这种分离度与再平衡时间的关系很重要，如果在⽅法开发中发现这种情况，我们就可以把再平衡时间延长到1.3 min以避免这种敏感性对分析结果造成影响。
图2：再平衡时间对⼩分⼦亲⽔化合物⽤HILIC柱梯度洗脱结果的影响（0.30，0.63，1.3，5.0，10和15 min）。再平衡时间为15 min时三个重复试验的⾊谱柱叠加在⼀起来展⽰⼀个给定再平衡时间是的准确性。其中⾊谱柱为AdvanceBio Glycan Mapping (50 x 2.1-mm i.d., 2.7-µm)；梯度为0-1.5 min,95%-80% B。流动相A为100 mM⼄酸铵（⼄酸调节⾄pH 6.0），流动相B为⼄腈；柱温35℃，流速1.2 mL/min。分析物为：1) acenaphthene，2) diphenhydramine，3) benzoic acid，4) cytosine，5) 5-methylcytidine，6) normetanephrine。
金鱼俱乐部更多的数据在图3中展⽰出来。在这⾥，我们已经绘制出了每个分析物在使⽤了不同的再平衡时间时的保留时间的差异。也就是说，这个图展⽰给我们哪些化合物在减少再平衡时间时保留增强，哪些化
合物在减少再平衡时间时保留减弱。我们看到当绝⼤多数的分析物的保留和再平衡时间只有微弱的关系，苯海拉明在再平衡时间缩短时保留明显增加。再平衡时间对5-甲基胞苷（5-methylcytidine）和苯甲酸（benzoic acid）的保留有⼀定的影响，但是并不⾜以影响这些分析物和它们相邻峰的分离度。
图3：和图2相同的分离的实验整理出来的保留时间和再平衡时间的关系图
如上⾯所述，我们在再平衡这个主题上的绝⼤多数的⼯作都是通过这种⾮常规的仪器来实现的，以保证进样之间以及梯度洗脱循环的时间的精准控制。这些结果与⼆维液相⾊谱（2D-LC）直接相关，因为⼆维分离是通过两个分离之间精准的时间控制来实现的，然⽽由于在分析之间的数据处理和其他设备初始化步骤让使⽤者对时间的控制更弱，因此有⼀个问题是进样之间的平衡时间的变化是如何影响HILIC⽅法的可重现的保留的。为了评估这个，我们搭建了⼀个常规的液相仪器来做类似图2的分离实验，但是使⽤的柱⼦更长，分析时间也更长以获得更典型的分析结果。我们接下来连续做了40个HILIC分离实验，⽤的分析物和图2的⼀致，⽅法程序中再平衡的时间仅设置为30 s，也就是相当于这些条件下的两个柱体积。如图4为40个分离的保留时间的标准偏差，这个实验结果⾮常明确地显⽰在常⽤的仪器中，只使⽤两个柱体积的再平衡就可以获得具有⾼度重现性的HILIC梯度分析数据，当然前提是再平衡时间⽐tflush更长。计算机的分类
图4：对6个组分混合物的HILIC梯度分离的保留时间的重现性。⾊谱条件——仪器：Agilent 1290 UH
PLC双泵洗脱；⾊谱柱：AdvanceBio Glycan Mapping (150 mm x 2.1mm i.d., 2.7-µm)；梯度：0-6.0-6.01-6.5 min，95-85-95-95 %B；流动相A是100mM⼄酸铵（⽤⼄酸把pH调到6），B相为⼄腈；温度35℃；流速0.6 mL/min。
结论
我们发现在梯度⽅法中即使没有⽤起始流动相将⾊谱柱冲洗到真正的平衡状态，也能获得具有好的重现性的⾊谱结果——即使是使⽤常规的液相仪器进⾏HILIC模式分析。当然在⼀些情况下，⾮常短的再平衡时间不能得到令⼈满意的结果，因此我们建议再平衡时间在⽅法开发过程中应该被系统地考察以更好地理解它对保留和分离度的影响。正如以前John Dolan在关于这个问题的讨论中很明智地指出，稍微过度的平衡⽐平衡不够充分要好得多。然⽽，显著减少再平衡时间也是提⾼样品分析通量、降低分析成本的⼀种潜在的有效⽅式。华南师大bbs
时间也是提⾼样品分析通量、降低分析成本的⼀种潜在的有效⽅式。
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