少年军校活动被写入哪部法律
ELISA或免疫印迹检测:可以使⽤镍螯合的辣根过氧化物酶来进⾏基于HRP组氨酸标签蛋⽩的检测⽽⽆需使⽤抗体。同时,抗6xHis的抗体是⾼度灵敏和特异性的对于那些含有组氨酸标签的蛋⽩。 凝胶染⾊:⼏种免疫分析⽅法利⽤多组氨酸标签通过抗多组氨酸标签抗体或通过SDS-PAGE来检测靶蛋⽩。
3. 蛋⽩相互作⽤
蛋⽩相互作⽤pull-down:镍琼脂糖树脂可以⽤于纯化,鉴定和检测组氨酸标签蛋⽩的相互作⽤。 浙江同志网
⽂献解读
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上⾯的图⽚来源于2016年发表在《Immunity》上的Analysis of the Rab GTPase Interactome in Dendritic Cells Reveals Anti-microbial Functions of the
Rab32 Complex in Bacterial Containment,⽂献中就采⽤了6xHis标签来纯化Rab蛋⽩,只是⽂献中为了提⾼蛋⽩相互作⽤的可信度,提⾼蛋⽩的纯化效果,采⽤的是2个标签的纯化⽅法。
etrust从(a)图中可以看到FUYW-exact-6His-Rab字样,这说明在Rab分⼦的N端加上了⼀个6xHis标签与eXact标签,eXact标签是⼀个能够⾃割切的枯草杆菌结构蛋⽩。在(b)图中我们可以继续看到,6xHis与Rab分⼦之间还加上了⼀个EYFP标签,这主要是为了⽅便构建慢病毒稳转细胞时筛选,因此⽂献中还提到了使⽤空的EYFP质粒来做了阴性对照。
⽂献中做蛋⽩相互作⽤的⼤致流程如下所⽰(其实图(b)就是纯化蛋⽩的过程):
1. 构建稳定表达的eXact-6xHis-EYFP-Rab整合蛋⽩的DC
2.4细胞;
2. 通过eXact-6xHis两个标签进⾏亲和纯化,其中eXact这个标签的特征在于它⽆需抗体进⾏纯化,因此就会降低引⼊⾼浓度外源抗体对质谱分析
有所谓
的影响,当溶液中的N3-离⼦浓度升⾼后,就会诱导eXact标签与⽬的蛋⽩之间的酶切,从⽽导致eXact标签被固定的蛋⽩酶滞留在介质上,此时洗脱下来的就是6xHis-EYFP-Rab重组蛋⽩;
3. 使⽤Ni-NTA纯化柱来纯化6xHis-EYFP-Rab蛋⽩。
参考资料
1. 6xHis 标签的特点以及它的使⽤⽅法
2. Purification of proteins by IMAC
3. Janeway's Immunobiology 9th
4. Profinity IMAC 树脂白喉杆菌
5. Analysis of the Rab GTPase Interactome in Dendritic Cells Reveals Anti-microbial Functions of the Rab32 Complex in3g视频服务器
Bacterial Containment