植物保护学现代农业科技2015年第23期
摘要通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法，从枯草芽孢杆菌SYL-6菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物进行抑菌试验，结果表明该物质对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外，该物质对热稳定，能耐受较广的pH 值范围，对紫外线有较好的稳定性。 关键词枯草芽孢杆菌；脂肽类化合物；分离；稳定性中图分类号S476文献标识码A 文章编号1007-5739(2015)23-0114-02
Isolation and Stability Analysis of Lipopeptides Compound Produced by Bacillus subtilis Strain SYL-6
WANG Ji-liang 1YANG Jin-ku 1FENG Zheng-guang 1LIU Xiao-jie 1HUANG Juan-ying 1SUN Hui-gang 2
(1Langfang Academy of Agricultural and Forestry Sciences in Hebei Province ,Langfang Hebei 065000;2Xuzhou Institute of Technology )
Abstract An antimicrobial substance of lipopeptides were isolated from the suspension of Bacillus subtilis strain SYL-6by hydrochloric acid precipitation and methanol extraction ,and bacteriostasis test was carried out.The results showed that the substance had inhibitory effect on a variety of plant pathog
enic fungi.In addition ,the substance was stable to high temperature with wider pH value range.It also had good stability to ultraviolet.
Key words Bacillus subtilis ;lipopeptides compound ;isolation ;stability
枯草芽孢杆菌SYL-6脂肽类化合物的分离与稳定性分析
血红素加氧酶王继良1杨金库1冯争光1刘晓杰1黄娟英1孙会刚2
(1河北省廊坊市农林科学院，河北廊坊065000;2徐州工程学院)
随着世界各国对植物病害生物防治的日趋重视，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )被广泛研究和应用[1-3]。该真菌在生长代谢过程中产生多种抑菌物质，其中低分子的抗菌肽是一种比较重要的成分。脂肽类化合物一般是由β-氨基或羟基脂肪酸与7个或10个氨基酸连接的环肽，能抗真菌、细菌以及病毒。
枯草芽孢杆菌SYL-6是一株可高效防治番茄晚疫病菌的生防细菌。本试验对该菌株产生的脂肽类物质的分离、抑菌效果及稳定性进行了初步研究，为进一步有效利用该
产物奠定基础。1材料与方法1.1供试菌株枯草芽孢杆菌菌株SYL-6为徐州工程学院实验室分离
并保存。
细菌指示菌株分别为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus )以及致病疫霉(Phytophthora infestans )、尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporium f.sp.cucumarinum )、尖镰孢菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp .Vasinfectum )、灰葡萄孢(Botrytis cinerea )、梨生囊孢壳(Physalospora piricola )、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )为河北省廊坊市农林科学院中心实验室保存。
1.2脂肽提取物的制备
从菌种保存试管斜面中挑取1环SYL-6菌体，接种到LB 培养基中，置30℃、150r/min 振荡培养24h 作种子接种
液。将种子液以1%的接种量接入到装有100mL 的LB 培养液的三角瓶中,31℃、150r/min 培养72h 。培养结束后，将发酵液于4℃、11000×g 离心15min 去菌体，用6mol/L 的HCl 将上清液调节pH 值至2.0，静止过夜。然后,4℃、11000×g 离心15min ，收集沉淀，沉淀干燥后加入适量甲醇抽提2次，合并抽提液得到脂肽粗提物，旋转蒸发得到黄晶体。
将黄晶体加入无菌水溶解，用NaOH 调节pH 值至7.0，用细菌过滤器(Φ=0.22μm )过滤，滤液用6mol/L 的HCl 将上清液调节pH 值至2.0，静止过夜。4℃、11000×g 离心15min ，收集沉淀，加入适量甲醇得到10mg/mL 的脂肽提取液，放入冰箱备用[4-6]。1.3抗菌试验
以6种致病真菌作为目标菌，测定脂肽提取物对它们的抑制率。在PDA 平板中央放置直径5mm 病原真菌菌盘，距菌盘20mm 的4个点上放置牛津杯，每个牛津杯加入150μL 的脂肽类提取液；以只接病原菌的PDA 平板作对
照,25℃培养，待对照长满平板后计算抑菌率。
抑菌率(%)=(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落
半径×100
1.4脂肽提取物稳定性分析
1.4.1对温度的敏感性。将脂肽提取液分别置于40、60、80、100、121℃下处理25min ，冷却至室温后在涂布指示菌株蜡样芽胞杆菌的培养皿上做抗菌试验，观察抑菌活性的变化。1.4.2
对酸、碱的敏感性。用HCl 或NaOH 将脂肽类提取
液pH 值分别调至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，静置30min 后11000×g 离心5min ，取上清液，在涂布指示菌株蜡样芽胞杆菌的培养皿上做抗菌试验，观察抑菌活性变化。
1.4.3对紫外线的敏感性。将脂肽提取液分别在紫外线下15cm 处照射2、4、6、8、10、12h 后，在涂布指示菌株蜡样芽胞杆菌的培养皿上做抗菌试验，观察紫外线不同处理时间
抑菌活性的变化[7-10]。2结果与分析2.1抗菌试验
枯草芽孢杆菌菌株SYL-6的脂肽类提取物对6种病原真菌均有很好的抑制作用。其中，对致病疫霉和梨生囊孢壳的抑制效果最明显，抑菌率达到75%以上。对其余4种致病菌的抑制作用也比较强，均达到50%以上(表1)。试验结果表明，枯草芽孢杆菌菌株SYL-6的脂肽类提取物具有广谱的抑菌活性。
基金项目河北省科技计划项目(14226501D )。
作者简介王继良(1980-)，男，河北廊坊人，硕士，助理研究员，从事
植物保护方面研究工作。
收稿日期2015-11-05
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焦痂2.2脂肽提取物稳定性分析
2.2.1对温度的敏感性。枯草芽孢杆菌菌株SYL-6的脂肽类提取物经过100℃以下作用25min 后，抗菌物质仍然具有活性且活性大小基本不变，只是在121℃下抑菌效果消失(图1)，这表明抗菌物质有较强的热稳定性。
2.2.2对pH 值的敏感性。枯草芽孢杆菌菌株SYL-6的脂肽类提取物在酸性条件下，抑菌活性基本不变；在pH 值为9.0时，抑菌活性略有下降;pH 值为11.0时基本没有活性(图2)。试验结果表明，该物质总体可以耐受的pH 值范围
较广。2.2.3
对紫外线的敏感性。从图3可以看出，枯草芽孢杆
菌菌株SYL-6的脂肽类提取物在紫外线下照射不同的时间后，其抑菌活性基本不变，连续照射12h 后仍具有明显
供试病原菌抑制率∥%
致病疫霉(Phytophthora infestans )78.33尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporiumf.sp.cucumarinum )
60.00尖镰孢菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp .Vasinfectum )58.26灰葡萄孢(Botrytis cinerea )54.55梨生囊孢壳(Physalospora piricola )77.78立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )63.64
母系社会
表1
枯草芽孢杆菌菌株SYL-6的脂肽类提取物对
不同病原菌的抑制率
图1温度对菌株SYL-6
代理服务
脂肽类提取物抑菌活性的影响图2pH 值对菌株SYL-6
脂肽类提取物抑菌活性的影响
图3紫外线对菌株SYL-6脂肽类提取物抑菌活性的影响
的抑菌活性。因此可以认为，该抗菌物质有较好的紫外稳定性。3结论与讨论
本研究通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法，从枯草芽孢杆菌SYL-6菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物。通过抑菌试验证明了该物质对致病疫霉、梨生囊孢壳、尖镰孢菌黄瓜专化型、尖镰孢菌萎蔫专化型、灰葡萄孢以及立枯丝核菌具有明显的抑制作用，其中对致病疫霉和梨生囊孢壳的抑菌率达到75%以上。抑菌试验结果表明该物质抑菌活性高，抑菌范围广。脂肽提取物稳定性分析试验
显示，该物质对热稳定，能耐受较广的pH 值范围，对紫外线也有较好的稳定性。由于枯草芽孢杆菌菌株SYL-6产生的脂肽类化合物具有抑菌活性高、抑菌范围广，且稳定性比较好的特点，因此可以在生物农药的开发方面进行更加深入的研究。4参考文献
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(下转第117页)
王继良等：枯草芽孢杆菌SYL-6脂肽类化合物的分离与稳定性分析
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(上接第115页)
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大于0.05，差异不显著。
综合以上分析可知,4种除草剂对葎草都有较好的防治效果。其中,41%草甘膦异丙胺盐水剂0.9g/m 2、25%环嗪酮可溶液剂1.1mL/m 2、10%甲嘧磺隆悬浮剂0.7g/m 2和40%扑草净可湿性粉剂0.30g/m 2能达到彻底杀灭葎草的防治效果。3讨论
葎草除了有害的一面之外，还有一定利用价值，如在药用方面，具有清热解毒、利尿消肿作用，可内
服外用。此外，幼草在成株尚未长出刚毛前，可以作为饲料。因此，葎草的防治，要考虑森林健康与林业有害生物的精确管理，以及葎草的生物学与生态学特性，应该采取积极利用与综合治理的原则[2-7]，笔者认为，就化学防治而言，应该只对大面积连片发生区进行，且一般在花前进行。对于葎草零星发生区，尽量不要使用化学药剂进行防治，应该在花前人工割除。
科学管理研究
4参考文献
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求和平均方差行14336.184.02512.52917行24369.692.429.33333行34390.597.6258.4025行444001000
列14373.993.47571.1825列24364.191.02578.2825列34388.797.17531.9225列4
4
369.5
92.375
41.34917
表4防除效果的方差分析
差异源SS df MS F P-value F crit
行601.00253200.334226.827478.04×10-5
3.862548列83.5875327.8625 3.7311680.054243 3.862548误差67.207597.4675总计
751.7975
15
表5防除效果的方差显著性分析
图1不同药剂对葎草的防治效果分析
(a :41%草甘膦异丙胺盐水剂;b :25%环嗪酮可溶液剂;c :10%甲嘧磺隆悬浮剂;d :40%扑草净可湿性粉剂拟合优度
)
100.085.090.095.080.0数量化编码
100.085.090.095.080.0数量化编码
100.085.090.095.080.0
数量化编码
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数量化编码
查达球：葎草化学防治技术研究
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