植物学报C A?/>?e s e 8iv//e f/>7 of Bofany 2021, 56 (2): 191-200, www.chinbullbotany doi: 10.11983/CBB20179
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刘佩佩，张耿，李晓娟’
北京林业大学生物科学与技术学院，林木分子设计育种高精尖创新中心，
摘要果胶作为植物细胞壁多糖之一，其结构和功能非常复杂。果胶主要由同型半乳糖醛酸聚糖(HG)、鼠李半乳糖醛酸聚 糖I (RGI)和鼠李半乳糖醛酸聚糖II (RGII)组成。果胶类成分在维持细胞壁结构的完整性以及细胞间黏附和信号转导等方面 发挥重要作用。研究果胶类成分的结构、分布和功能，对理解细胞壁高级结构的构建和功能具有重要意义。然而，3种果胶 组分在细胞壁内如何交联形成高级结构并发挥生物学功能，目前尚不明确。该文重点阐述果胶3种组分(HG、RGI和RGII)的生物合成、功能以及果胶的显微成像，旨在为植物果胶结构及功能研宄提供参考。 关键词生物合成，果胶功能，显微成像，果胶组分
刘佩佩，张耿，李晓娟（2021).植物果胶的生物合成与功能.植物学报56, 191-200.
北京100083
细胞壁作为植物细胞的屏障，在维持细胞膨压、完整性以及细胞间信号交流方面具有重要作用(Cosgrove,2005)。细胞壁包括初生细胞壁和次生细胞壁, 均由多糖和少量蛋白组成(Logan et al., 2014)，但组 成成分和功能有所不同。其中初生细胞壁主要由纤维 素、半纤维素和果胶组成(解敏敏等,2015)，具有可塑 性，可以适应植物细胞生长过程中的动态变化，对植 物细胞的形态建成具有重要作用(Sakamoto et al., 2018)。次生细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质 素组成(Zhong and Ye, 2015)，刚性较强，可赋予植 物强度和硬度(Cosgrove and Jarvis, 2012; Li et al., 2016；张雨等，2020)。初生细胞壁纤维素含量较少，果胶多糖含量较多，在双子叶和非禾本科植物中，果 胶约占初生细胞壁的35%(Cosgrove and Jarvis, 2012)。次生细胞壁的果胶含量尚不明确，但有研究 表明，杨树(Populus trichocarpa，P.nigra x p,maxi-mow/.cz",P.fn’crtocarpa x p. /(oreana)成熟木质部中 有类果胶（pectin-like)组分在次生细胞壁中沉积(Arend et al., 2008)。
作为植物细胞壁的重要组分，果胶广泛存在于高 等植物的根、茎和叶等器官的细胞壁和细胞间隙中，在植物生长发育、防御和细胞壁完整性等方面具有重 要作用。果胶多糖是自然界中结构最复杂的多糖家族, 组成成分主要包括同型半乳糖醛酸聚糖(homogalac-turonan,HG)、鼠李半乳糖醒酸聚糖丨沖曰
⑴叩日此- turonan I,RGI)和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(rhamnga-lacturonan II,RGII)，不同的果胶结构域在细胞壁中 彼此共价连接(Atmodjo et al.,2013)。然而，这3种组 分的交联方式与其功能之间的关系尚不明确。因此，研宄果胶的结构与功能有利于更加深刻理解细胞壁 高级结构的构建与功能。本文主要从果胶HG、RGI 和RGII的生物合成、功能以及果胶的显微成像3个方 面进行综述。
1果胶多糖的生物合成
果胶组分在高尔基体中合成和修饰，然后通过共价键 相互连接形成果胶网络。果胶的合成过程需要多种酶 类参与。己有研究表明，果胶的合成至少需要67种不 同的转移酶，包括糖基转移酶、甲基转移酶和乙酰转 移酶(Mohnen,2008)。这些酶在顺式高尔基体、中间 高尔基体和反式高尔基体中参与构建果胶多糖的复 杂高级结构(Nebenfuhrand Staehelin, 2001)。
收稿日期：2020-11-10；接受日期:2021-01-21遗留问题
基金项目：国家自然科学基金(No.91954202)和北京林业大学“杰出青年人才”培育计划(NO.2019JQ03003) *通讯作者。E-mail:lixj@bjfu.
edu
192植物学报56(2) 2021
1.1 HG的生物合成
嘉兴秀州中学HG是a-1,4连接的半乳糖醛酸(a-1,4-linked D-galac-turonic acid,GalA)线性同聚物，在果胶中含量最高 (Mohnen,2008)。HG可以在C-6羧基处进行甲基化，参与甲基化修饰的酶包括HG半乳糖醛酸转移酶(ga-lacturonosyltransferases,GAUT)和果胶甲基转移酶 (pectin methyl-transferase,PMT)(Sebastian et al., 2009)。在数据库CAZy中检索发现，GAUT蛋白属于 糖基转移酶(glycosyltransferases,GT)家族8，该家 族在拟南芥(>A/-abZdops/_s f/)a//ana)中有15个成员。其 中参与果胶生物合成的酶有GAUT1(Sterling et al., 2006)、GAUT7 (Atmodjo et al.,2011)、GAUT4 (B is w a le ta l.,2O180tlGAUT
8(QUA1)(B o u to n e t al.,2002)。GAUT1是首个被鉴定的HG半乳糖醛酸转 移酶，它能在体外合成聚半乳糖酸酸(Sterling et al., 2006) ;GAUT7是GAUT1的同源蛋白，二者形成GAUT1:GAUT7复合物，共同参与细胞壁基质多糖的 生物合成(Atmodjo et al.,2011); GAUT4可以合成 HG，其表达下调使细胞壁中的HG和RG-II减少旧丨5- wal et al., 2018); q u a f突变体中HG含量极低，表明 QUA1可能参与果胶的生物合成（Bouton et al., 2002)。PMT通过催化S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基转移 到果胶HG中a-1,4连接的半乳糖醛酸残基的羧基上, 使H G发生甲基化修饰(Liu et al.,2015)。PMT与GAUT可能作为异源复合体参与HG的聚合，使HG完 全甲基化(即甲基化程度达到80%)。此外，HG的一些 GalA残基在0-2或0-3处可发生乙酰化修饰（易建勇 等，2020)。甲基化和乙酰化的酯化程度是动态可变 的，其修饰的程度影响果胶的理化性质。例如，在 Ca2+的作用下，两条HG链之间相互作用形成二聚体。值得注意的是，至少需要9个未甲基化修饰的GalA残 基的连续延伸才能实现此同型二聚体(Scheller et al., 2007) 。
1.2 RGI的生物合成
R G I占果胶成分的20%-35%，与HG和RGII不同，它 的主链由双糖重复链[4)-a-D-GalA-(1,2)-a-L-Rha-(1，]n组成。RGI主链中的大部分或全部GalA在0-2或 0-3处被乙醜化修饰，大多数鼠李糖(rhamnose, Rha)残基可在0-4处被线性或支链寡糖或多糖取代 (Atmodjo et al.,2013)。RGI侧链包括(3-1,4-半乳聚糖、阿拉伯聚糖或阿拉伯半乳聚糖等。RGI生物合成 过程中，其主链和侧链合成所需酶不
尽相同，主链合 成需要半乳糖酸酸转移酶(galacturonosy丨transferase,GalAT)和鼠李糖基转移酶(rhamnosyltrans-ferase,RhaT)参与，而個ij链合成需要半乳糖基转移 酶(galactosyltransferases,GalTs)和阿拉伯糖基转 移酶(arabinosyltransferases,AraTs)。目前在拟南芥 中己有报道的GalTs和AraTs编码基因包括GT92家 m^JGALSI(GALACTAN SYNTHASE 1)(Liwanag 6言31.,2012)和6丁47家族巳亚中的>4尺/\〇7(々尺/\- D£/=/C/EA/V f)(Harholt et al., 2006)及其同 源基因(Harholt et al.,2012)。其中GALS7基 因功能缺失和过表达分别导致细胞壁半乳聚糖的减 少和增加(Liwanag et al.,2012)。对arad7突变体的生 化分析显示，突变体细胞壁中的阿拉伯糖数量明显低 于野生型(Harholt et al., 2006)；而对arac/2突变体细 胞壁的生化分析显示，其单糖组成与野生型无明显差 异，且过表达/\fM D2并不能完全恢复arad彳的表型, 说明虽然/\R/AD7与々R/\D2同源，但是二者功能并不 冗余，推测这2个糖基转移酶可能在二硫键连接的复 合物形成中发挥作用(Harholt et al.,2012)。
1.3 RGII的生物合成
RGII的结构非常复杂，由至少12种不同的单糖构成, 其主干是HG，主干上带有4个不同的侧链(A-D)，链 A和B在拟南芥中分别被描述为高度分化的八糖和七 糖，链C和D是双糖(Glushka et al., 2003; Pabst et al.,2013)。值得注意的是，侧链A和B的单糖组成中都 含有芹菜糖残基(apiosyl,Api)，而侧链A的芹菜糖残 基是形成硼酸二酯键的关键位点(Funakawa and Miwa, 2015)。目前，对RGII生物合成的研究较少，已确定参与RGII生物合成的酶有鼠李半乳糖醛酸木糖 基转移酶 1-4 (rhamno galacturon
an xylosyltrans-ferase,RGXT1-4)，它们属于GT77的B亚，具有 〇-1,3-木糖基转移酶活性，能将UDP-Xyl转移到岩藻 糖(fucose,Fuc)上。RGXT7和RGJXT2在拟南芥幼苗 和成熟植株的营养组织中均有表达，二者突变体的生 长表型与野生型相比均无明显变化(Egelund et al., 2006); RGXT^仅在成熟植株的叶片和角质层中表达 (Egelund et al., 2008); RGXT4在许多器官和组织中 都有表达，其功能缺失会严重影响花粉管和根的生
长，导致植株不育和幼苗死亡(L iu e ta l.,2011)»
2果胶多糖的功能
边缘化细胞壁在植物生长过程中起重要作用，其结构影响细 胞和组织器官的坚固性和初性等力学特征。同时，细 胞壁还参与生物胁迫和非生物胁迫引起的植物防御 反应。果胶作为细胞壁的成分之一，主要由HG、RGI 和RGII共价交联而成,3种组分的结构、修饰和交联特 征与细胞壁强度、细胞黏附和细胞壁的防御功能等密 切相关。
2.1果胶类多糖有利于增强细胞壁的机械性能
2.1.1去甲基酯化的HG可以增强细胞壁刚性及弹性HG在高尔基体中以高甲基酯化的形式合成，随后由 果胶甲基酯酶(pectin methylesterase,PME)选择性 地去甲基酷化(Caffall and Mohnen,2009)，同时释
放甲醇和质子(查笑君等，2010)，生成带负电荷的羧 基(Wormit and Usadel, 2018)。去甲基酯化的HG可以增强细胞壁的刚性。例如，PMEs催化HG去甲基酯 化后可形成连续的GalAs，在Ca2+存在时，带负电荷 的羧基与Ca2+相互作用，形成“鸡蛋盒”（Egg Box Model)结构(图1)。该结构可以通过增强细胞壁刚性来 维持细胞壁的完整性(Micheli,2001; Braccini and Per6z, 2001)；花粉管的顶端区域几乎只存在甲基酯 化的果胶，外源施加PME时可诱导其尖端细胞壁增 厚，从而抑制花粉管生长(Bosch e ta l., 2005)。此外, PME去甲基酯化HG的过程中会导致局部pH降低，激 活多种细胞壁降解酶，从而促进细胞壁的扩张，使其 弹性增强。相反，当植物体缺少PME时，细胞壁的弹 性降低。研究发现，果胶甲基酯酶6 (PME6)在保卫细 胞中表达量较高，野生型保卫细胞富含未酯化的HG，而突变体pm e6-7的保卫细胞壁富含甲基酯化的果胶，其气孔开启/关闭动态范围缩小，表明异常的果胶甲 基酯化改变了保卫细胞的机械特性，导致气孔无法根 据环境信号进行适度的开放与关闭(Amsbury et al., 2016)。
2.1.2 RGI侧链参与细胞重塑以及増强细胞壁硬度RGI侧链包括p-1,4-半乳聚糖、阿拉伯聚糖或阿拉伯 半乳聚糖，其组成和结构影响细胞壁的强度、弹性和
刘佩佩等：植物果胶的生物合成与功能193
模型(改自 Micheli, 2001; Braccini and Per6z, 2001)
高甲基酯化的HG被果胶甲基酯酶(PME)去甲基酯化，产生带 负电荷的羧基。在Ca2+存在时，2条HG链的羧基与Ca2+相互作 用，形成“鸡蛋盒”结构。
Figure 1An "egg-box" model of homogalacturonan (HG) polysaccharide and Ca2+cross-linking (modified from Mich- eli, 2001; Braccini and Perez, 2001)
Hypermethylated HG is de-methylated by pectin methyles- terase (PME) to produce negatively charged carboxyl groups. In the presence of Ca2+,the carboxyl groups of the two HG chains interact with Ca2+ to form an "egg box" structure.
柔韧性等机械性能。例如，侧链阿拉伯聚糖和阿拉伯 半乳聚糖的长度和数量部分决定初生细胞壁的相对 灵活性，而半乳聚糖含量增加有助于增强细胞壁的硬 度和刚度(Ulvskov et al., 2005; Moore et al., 2008)。Cankar等(2014)通过表型观察和组分分析，对编码 果胶修饰、主链降解和侧链类型等酶的多个转基因马 铃薯(So/anum fuberosivm)株系进行研究，发现果胶 主链被鼠李半乳糖醛酸裂解酶(rhamno galactu-ronanlyase,RGL)裂解为片段的转基因株系，以及阿 拉伯聚糖含量降低70%的转基因株系中，成熟花粉粒 的内壁在亲和孔的位置外翻突起，最终导致花粉粒破 裂和细胞质泄漏，这些结果证实在花粉粒成熟和脱水 过程中，果胶阿拉伯聚糖侧链在细胞壁重塑过程中发 挥了重要作用。McCartney等(2000)通过对(1—4)- P-D-半乳聚糖出现前后的豌豆(P/sum saf/Vivm cv.‘Avola’)子叶进行孔刚玉
机械压应力测试，发现细胞壁富含 半乳聚糖的子叶硬度明显增强。此外，RGI侧链的组 成和结构与细胞和组织的发育阶段密切相关。例如，在胡萝卜（Daucus carofa cv.‘Early Nantes’）由细胞 分裂向细胞伸长过渡时，
伴随着细胞壁果胶半乳聚糖
194植物学报56(2) 2021丁俊发
产品标识标注规定
Gal - GIcA -\F u c Rha - GalA GalA
侧链A
野生型中的RGII 二聚体
侧链A
•
GalA
Gal GIcA \F u c / Rha - GalA
侧侧侧
%
图2
拟南芥野生型和rmvd 突变体中的鼠李半乳糖醛酸聚糖II (RGII)二聚体(改自O’Neill et al., 2004; Atmodjo et al., 2013)
野生型植株中的鼠李半乳糖醛酸聚糖丨丨：聚体由侧链A 的芹菜糖残基通过硼酸：酯键共价交联而成。MUR1催化GDP-L-岩藻糖从头 合成的第一步，MUR1功能缺失导致GDP-L-岩藻糖合成受阻。因此，rmvrf 突变体中的鼠李半乳糖醛酸聚糖II 侧链A 被截断，这一缺 陷导致鼠李半乳糖醛酸聚糖丨丨二聚体的形成减少。H G ：同型半乳糖醛酸聚糖;A p i：芹菜糖；Rha：卜鼠李糖；Fuc: L-岩藻糖；GI
cA: D- 葡萄糖醛酸；Gal: L-半乳糖；GalA: D-半乳糖醛酸；Me xyl: 2-0-甲基-D-木糖
Figure 2 Rhamngalacturonan II (RGII) dimer in Arabidopsis wild-type and mur1 mutants (modified from O'Neill et al., 2004; Atmodjo et al., 2013)
In wild-type plants, RGII dimers are formed between Apiosyl residue of side chain A which are cross-linked covalently by the diester borate bonds. MUR1 catalyzes the first step in the de novo synthesis of GDP-L-fucose. The loss of MUR1 function leads to the block of GDP-L-fucose synthesis. Therefore, the RGII side chain A was truncated in mur1 mutants which resulted in reduced formation of RG-II dimers. HG: Homogalacturonan; Api: D-apiosyl; Rha: L-rhamnose; Fuc: L-fucose; GIcA: D-glucuronic acid; Gal: L-galactose; GalA: D-galacturonic acid; Me xyl: 2-O-methyl-D-xylose
的出现和阿拉伯聚糖减少；豌豆子叶在发育中随着果 胶半乳聚糖的出现表现出组织硬度增强(Willats et al .，1999; McCartney et al ., 2000)。2.1.3 RGII 二聚体有助于增强细胞壁强度
RGII 结构虽然复杂，但其结构在植物中高度保守 (Matsunaga et al ., 2004)。在植物细胞壁中，90%以 上的RGII 以二聚体形式存在。如图2所示，RGII 二聚体 由侧链A 上的芹菜糖残基之间的硼酸二酯键共价交联 形成(O'Neill et al ., 2004; Atmodjo et al ., 2013)，侧 链A 的完整结构对RGII 二聚体的形成至关重要。当 RGM 完整性缺失时会影响植物的生长，导致植物矮 化(O’Neill et al ., 2001)和花
粉管伸长缺陷(Delmas et al ., 2008)，严重时可导致植物细胞死亡(Ahn et al ., 2006)。在拟南芥中，
(/WURUS ”编码GDP -甘
露糖-4,6-脱水酶，催化由GDP -D -mannose 到GDP - L -focuse 的第1步合成。GDP -レfocuse 是L -岩藻糖(L -focuse , 6-deoxy -L -galactose )的活化核苷酸糖形式,L -岩藻糖是RGII 侧链A 的单糖组成之一，也是其它多 种结构多糖和糖蛋白的组成部分(Zhang e ta l ., 2019)。 ML /R 彳功能缺失突变体mu /•彳植株矮化，RGII 交联率降 低(O’Neill et al ., 2001)，可能是由于侧链A 截断所致 (Pabst et al ., 2013)。进一步研宂发现，mu /•彳突变体侧 链A 中的L -focuse 被L -Gal 取代后，全长侧链的比例降 低，导致RGII 对硼的亲和力降低，二聚体形成减少, 造成mu /•彳植株地上部矮化(Reuhs et al ., 2004)。在植 物细胞壁中，硼将2条RGII 链连接在一起形成二聚体, 增强了细胞之间的黏附和机械强度。研究发现，通过 补充硼可增加RGII 的交联比例，同时减弱m ur /突变 体的矮化表型，表明硼酸盐引起的RGII 交联对植物 正常生长至关重要(O’Neill et al ., 2001)。2.2果胶类多糖参与介导防御反应
细胞壁作为抵御病原体的屏障，其完整性为植物防御
-個
链D
I 侧链B T 侧链
C
刘佩佩等：植物果胶的生物合成与功能195
病原体所必需(Hamann,2015)。植物细胞壁果胶被细 菌和真菌分泌的果胶降解酶降解，其中HG降解后产 生去甲基酯化的果胶片段或寡聚半乳糖醛酸(〇阳〇- galacturonides,OGs)(Ferrari et al.，2013；郁有健 等，2014)。OGs作为激发子可被植物体内的受体识 别，从而激活一系列防御反应，起到保护植物的作 用。研宄表明，OGs的信号转导通过细胞壁关联激酶 (wall-associated kinases,WAKs)发挥作用，WAKs能 感知OGs，进而激活植物的应激反应(Brutus et al., 2010; Kohorn et al., 2014)。此外，病原体入侵会激 活PME,PME催化HG去甲基酯化过程中产生具有挥 发性的甲醇，甲醇可作为信号分子参与启动邻近植物 的免疫反应，增强邻近植物对细菌病原体的抵抗力 (Komarova et al., 2014)。
RGI和RGII也参与植物的防御反应。例如，Ji-m6nez-Maldonado等(2018)研究表明，RGI片段可使 番茄(S./ycopers/'cum)果实中的p-1,3-葡聚糖酶、几 丁质酶和过氧化物酶活性增强，从而激活番茄果实的 天然防御机制。Panter等(2019)通过研宄冷冻敏感基 因SFR8，发现它是/W L/R)的等位基因，且sfr8细胞壁 中岩藻糖水平较低，RGII交联减少，表明岩藻糖基化 对植物耐寒性的影响很可能通过调控
果胶RGII二聚 能力发挥作用。
3果胶显微成像
细胞壁是植物细胞特有的结构，与植物细胞的生长发 育密切相关(Bidhendi et al., 2020)，其成分和结构的可视化对于研究植物细胞的发育非常重要。果胶作为 一种重要的细胞壁多糖，其在细胞中的实时原位检测 和成分分析，对探宄果胶和细胞壁的整体结构和功能 具有重要意义。然而，果胶多糖种类较多，结构复杂, 因此对于果胶的显微成像目前还存在一定困难。本文 总结了 2种果胶多糖的成像方法，分别为糖抗体标记 法和代谢类似物标记法。
3.1糖抗体标记法
果胶多糖原位成像的方法之一是使用糖抗体，如单克 隆抗体(JIM系列和LM系列等)可以高分辨率和高灵敏 度地结合特定的多糖结构(1\^〇丨|6「613丨.，2008；卩31 tathil et al., 2010; Ralet et al., 2010)。使用荧光素标记单克隆抗体，当抗体与特定的果胶多糖结构结合后 形成带有荧光素的复合体，在荧光显微镜下使用合适 的激发光，即可观察多糖结构的定位与分布(Pattathil et al., 2010)。
在果胶多糖的3种组分中，对于HG的标记成像 研宄较多，用于标记HG的单克隆抗体有JIM5、JIM7 和2F4等。其中，JIM5的最佳识别表位可能是4个以上 相邻的未酯化GalA残基，这些残基与甲基酯化的
GalA残基相邻或在其两侧(Clausen et al.,2003); JIM7识别表位的重要特征是每隔一段残基上都有甲 基酯化的GalA残基(Clausen et al., 2003); 2F4可结 合钙离子交联的未酯化的GalA残基(5邮〇\^1<3-[^13- kowska and Borucki, 2015)。我们用JIM5和JIM7对 青扦(P/'cea w/7son/7)花粉管细胞壁中的果胶进行标记，在激光共聚焦显微镜下用488 nm激发并在500-550 nm处采集发射信号，可观察到在花粉管细 胞壁中，JIM7标记的高甲基酯化的果胶聚集在生长的 花粉管顶端，JIM5标记的低甲基酯化的果胶分布在花 粉管伸长处(Cui et al., 2015)。此外，我们利用JIM5 和JIM7免疫标记，还检测了杉木（Cunn/_ngf/7am/'a /anceo/afa>维管形成层细胞壁多糖在季节周期中的变化，结果显示，休眠期形成层细胞壁中富含低甲基 酯化的HG，而活跃期形成层细胞壁中高甲基酯化的 HG较多(Wu et al”2016)。Sujkowska-Rybkowska 和巳〇〇1〇1<；丨（2015)使用」11^5、」11^7和2「4分别对低甲 基酯化果胶、高甲基酯化果胶和钙交联果胶进行免疫 标记，检测铝处理的豌豆根瘤中果胶酯化和分布模式。Mravec等(2014)利用低聚壳聚糖(chitosan oligosaccharides,COS>与去酯化的 HG果胶可 以特异 性结合的特点，开发了非免疫标记分子探针。应用 Alexa Fluor 488偶联COS (COS488)标记去甲基酯化 HG，可以对其分布进行高分辨率荧光成像观察; COS与纳米金粒子耦合(COSA u N P)后，可以用于在透 射电子显微镜下对HG定位进行超微结构水平的观察。与抗体免疫标记相比较，COS488具有穿透速度快 和对酯化程度的变化敏感等特点，可用于活细胞实时 成像。
对RGI的标记研究表明，其主链和侧链的抗体标 记有所不同，其中中性侧链可被LM5半乳糖和LM6/ LM13阿拉伯糖抗体探针标记(Wu et al., 2016)，主链 可被INRA-RU1 和 INRA-RU2 标记（Ralet et al.,
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