Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报收稿日期：
2021-04-28基金项目：2019“青蓝工程”中青年学术带头人资助项目（00000219011）；江苏省高等学校自然科学研究重大项目（自筹）
（19KJA520008）；2020大学生创新创业项目（202012806057H）
作者简介：董亚青，女，硕士，讲师，主要是预防兽医学研究；王永娟，女，博士，教授，主要从事动物传染病与生物制药研究通信作者：2021,29(6): 16-21·研究论文·
摘 要：为探索RNAi 技术在鸭病毒性肝炎防控中的作用，本研究将筛选出的沉默RdRp 效果较好的shRNA1、shRNA2和突变体shRNA-NC 分别插入pPLK/GFP/+Puro 载体，构建慢病毒载体pPLK-shRNA-RdRp-1、pPLK-shRNA-RdRp-2、pPLK-shRNA-NC ，制备重组慢病毒Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-NC ；将重组慢病毒单独或者联合接种鸭胚成纤维细胞后感染DHAV-1，应用荧光定量PCR 的方法检测感染DHAV-1的鸭胚成纤维细胞上RdRp 基因的表达量及病毒TCID 50，判断siRNA 对病毒及病毒基因的抑制作用，并进一步将结果在鸭胚上进行检测。结果显示，Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-RdRp-1+2均能较好的抑制RdRp 基因的表 达，病毒感染后72 h ，三组的抑制效率均在95%以上，且在鸭胚中也能较好抑制DHA V-1的增殖，为鸭病毒性肝炎的防控提供了新思路和方向。关键词：慢病毒；鸭肝炎病毒；抑制；siRNA 中图分类号：S852.659.3
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文章编号：1674-6422（2021）06-0016-06
慢病毒介导的siRNA 对１型鸭肝炎病毒
复制的抑制作用
董亚青，彭仪伟，王永娟，施鑫蕊
（江苏农牧科技职业学院动物医学院，泰州225300）
Abstract: To explore the role of RNAi technology in the prevention and control of duck viral hepatitis, shRNA1, shRNA2 and mutant shRNA-NC were inserted into pPLK/GFP/+Puro vector to construct lentiviral vectors pPLK-shRNA-RdRp-1, pPLK-shRNA-RdRp-2 and pPLK-shRNA-NC for preparation of Lenti-shRNA-RdRp-1, Lenti-shRNA-RdRp-2 and Lenti-shRNA-NC. The recombinant lentivirus alo
ne or in combination was inoculated into duck embryo fi broblasts, which were then infected with DHA V-1. The expression of RdRp gene and virus TCID50 in infected duck embryo fi broblasts were tested by quantitative fl uorescence PCR to determine the inhibitory effect of siRNA on virus replication and virus gene expression. The results showed that Lenti-shRNA-RdRp-1, Lenti-shRNA-RdRp-2, Lenti-shRNA-RdRp-1+2 inhibited the expression of RdRp gene. After 72 hours virus infection, the suppression effi
ciency of all three groups was more than 95%. Furthermore, this inhibition effect was also tested and confi rmed on duck embryos. These results provided a new idea and direction for the prevention and control of duck viral hepatitis.Key words: Lentivirus; Duck hepatitis virus; inhibition; siRNA
Suppression of Duck Hepatitis A Virus 1 Replication by Lentivirus-Mediated siRNA
DONG Yaqing, PENG Yiwei, WANG Yongjuan, SHI Xinrui
(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, V eterinary College, T aizhou 225300, China)
· 17 ·第29卷第6期董亚青等：慢病毒介导的siRNA对１型鸭肝炎病毒复制的抑制作用
1型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHAV-1）属于小RNA病毒科的成员，主要引起雏鸭的急性病
毒性肝炎，该病传播速度快，病死率高，对养殖业的危害较大[1]。疫苗免疫接种是预防和控制DHAV-1感染最基本、最有效的措施，但近年来接种过DHAV-1疫苗的雏鸭也广泛发病，因此，寻新的预防和DHAV-1感染方法尤为重要。DHAV-1分子生物学的研究起步较晚，全基因组序列直到2006年才首次被报道[2]，基因组为约7690个核苷酸组成的单股正链RNA，编码2249个氨基酸，编码蛋白为：5'-UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3'UTR[3]。3D蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，RdRp），能特异性地识别病毒RNA，催化依赖RNA模板的基因组复制，在DHAV-1的基因复制过程中起着至关重要的作用[4]。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA诱发同源mRNA降解，使靶基因沉默的现象[5]。目前，RNAi技术已被广泛应用于研究基因功能、抗病毒感染、肿瘤等领域，该技术不仅在人病毒病防治方面成功尝试，在动物病毒病防治方面的研究也较多[6-8]。本研究在已筛选出的能有效沉默DHAV-1 RdRp基因siRNA的基础上，利用慢病毒载体表达siRNA以抑制DHAV-1的复制，并通过细胞和鸭胚来检测其抑制效果，为应用RNAi技术控制DHAV-1的感染奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA 聚合酶购自Fermentas公司；TRIzol购自北京鼎国公司产品；DMEM培养基购自GIBCO公司；HEK293T 细胞由扬州大学孙怀昌教授惠赠；DHAV-1 S
H毒株由中国农科院上海兽医研究所惠赠；鸭胚成纤维细胞为自制；鸭胚购自山东农业科学研究院；pPLK/ GFP/+Puro载体、即用型慢病毒包装质粒p M D
2.G和psPAX2购自镇江维根生物科技有限公司；pRdRp-shRNA1、pRdRp-shRNA2、pRdRp-shRNA-NC实验室制备保存[9]，其中，pRdRp-shRNA1干扰靶点序列为5'GCAATATGCAGGTAAGATTCT-3'、pRdRp-shRNA2为5'-GGGGATGACTGTGTTCTGTCA-3'。
1.2 重组慢病毒载体的构建Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切pRdRp-shRNA1、pRdRp-shRNA2、pRdRp-shRNA-NC质粒并分别回收shRNA1、shRNA2和shRNA-NC基因片段，再分别克隆于经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切的慢病毒pPLK /GFP/+Puro载体，重组后质粒命名为pPLK-shRNA-RdRp-1、pPLK-shRNA-RdRp-2、pPLK-shRNA-NC，并送至上海英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序鉴定。1.3 重组慢病毒的制备 按照说明书，取三质粒慢病毒包装系统20 μL，分别与pPLK-shRNA-RdRp-1、pPLK-shRNA-RdRp-2、pPLK-shRNA-NC、pPLK/GFP/+Puro转染至预先准备好的生长汇合度为70%~80%的状态良好的HEK293T细胞，转染方法参考文献[10]，转染后分别于48 h和72 h收集上清液，4℃、3000 ×g离心10 min，取上清液，0.45 μm微孔滤器过滤后保存。
1.4 重组慢病毒的纯化与滴度测定 将收集的慢病毒上清液分别与5×PEG8000浓缩液按4∶1的比例充分混匀，4℃放置过夜，4000 ×g、4℃离心20 min，弃上清液，静置1~2 min，去除残余液体，加入PBS 液，轻轻反复吹打，重悬慢病毒沉淀。采用逐孔稀释法进行重组慢病毒的滴度测定[13]。
1.5 siRNA慢病毒对鸭胚细胞转导效果检测为检测慢病毒对鸭源细胞的转导率，表达GFP的慢病毒（Lentil-GFP）以2 MOI转导鸭胚成纤维细胞，转导48 h后荧光显微镜下观察慢病毒的转导效果。同时收集转导细胞，PBS处理细胞至浓度为109个/L，然后从每个转染组细胞中随机选取3×104个细胞用流式细胞仪进行定量检测，判断慢病毒对鸭胚成纤维细胞转导率。
1.6 重组慢病毒沉默DHAV-1 RdRp基因表达的效果检测 将自制的鸭胚成纤维细胞按1×105/孔接种至24孔板中，培养至细胞密度约为80%时，新鲜培养基替换原培养基，按10 TU/细胞（转导单位）的剂量分别接种重组慢病毒悬液Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-RdRp-1+2、Lenti-shRNA-NC，500 µL/孔，37℃孵育培养，当转
· 18 ·2021年12月
中国动物传染病学报
染48 h后出现明显荧光细胞时，再以0.001 TCID50/TU 的DHAV-1 SH株分别感染[12]（n=3）。
1.6.1 RdRp基因沉默效果检测在DHAV-1 SH株感染后72 h，收集各孔细胞，取1份用于qPCR检测RdRp基因转录情况。按照TRIzol说明书提取总RNA，取1 µg总RNA反转录后用于荧光定量PCR 检测，选取GAPDH基因为内参基因。扩增RdRp基因序列的荧光定量PCR引物：RdRp-qPCR-F∶5'-TTAT
GGAGCAACTACAGA-3'，RdRp-qPCR-R∶5'-A A G T T A C A A G C C T C A A T G-3'，反应体系：PremixEx Taq TM（2×）反应液10.0 µL，正、反向引物各0.4 µL，探针0.8 µL，cDNA 1 µL，加ddH2O至20 µL；反应程序为：94℃预变性3 min；95℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，共40个循环；72℃再延伸7 min。使用Bio-Rad公司Rotor-Gene3000 Classic收集反应后Ct值，采用2-△△Ct法[11]进行数据分析。判断三组两个不同靶点的Lenti- shRNA -RdRp 对DHAV-1 RdRp基因的沉默效果。
1.6.2 抑制DHAV-1在细胞中的复制增殖 在DHAV-1 SH株感染后的24、48、72、96、120 h，分别取每个转导组的100 µL细胞上清液进行TCID50测定，以Lenti-shRNA-NC转导组为对照，计算三组重组慢病毒对DHAV-1 SH株复制的抑制情况。
1.7 重组慢病毒抑制DHAV-1在鸭胚中的复制增殖 以5×106 TU/胚的剂量，分别将重组病毒Lenti-shRNA-R d Rp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-RdRp-1+2以及对照病毒Lenti-shRNA-NC经卵黄囊接种8日龄健康鸭胚，每组10个鸭胚（n=3），37℃培养箱孵化。重组病毒接种2 d后，以1000 TU/TCID50的比例经绒毛尿囊膜接种DHAV-1 SH。在感染后5 d和6 d，每组分别收获3个感染鸭胚的胚体与尿囊液，剪碎后加入PBS，于-20℃反复冻融4次，4000 ×g离心10 min后，收集上清液超滤除菌，用DMEM基础培养基进行10倍梯度稀释，分别接种96孔培养板中长成单层的DEF（鸭胚成纤维细胞），每孔100 µL，每个稀释度重复8孔，设未感染正常细胞对照。于37℃、5%CO2培养箱中培养，
连续观察5 d并记录结果，按Reed-Muench法计算TCID50[13]。同时观察剩余鸭胚死亡情况，并记录。
2 结果
2.1 重组慢病毒载体的构建借助DNA重组技术，将shRNA1、shRNA2和shRNANC基因片段，分别克隆至慢病毒pPLK/GFP/+Puro载体，获得了测序正确的慢病毒重组质粒，分别命名为pPLK-shRNA-RdRp-1、pPLK-shRNA-RdRp-2、pPLK-shRNA-NC。
2.2 重组慢病毒的制备 采用第三代质粒慢病毒包装系统在293T细胞中包装shRNA慢病毒，获得的重组慢病毒分别命名为Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-NC、Lentil-GFP，病毒上清液用pEG-it浓缩后测定滴度，结果显示包装的慢病毒滴度高达1×109 TU/mL。
2.3 siRNA慢病毒对鸭胚细胞转导效果检测慢病毒Lentil-GFP转导鸭胚成纤维细胞48 h后荧光显微镜下观察，与流式细胞仪检测结果一致（图2），Lentil-GFP对鸭胚成纤维细胞的转导率几乎为100%（图1、2）。
2.4 重组慢病毒沉默DHAV-1 RdRp基因表达的效果检测
2.4.1 RdRp基因沉默效果检测鸭胚成纤维细胞分别转导Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2
、Lenti-shRNA-RdRp-1+2、Lenti-shRNA-NC后感染DHAV-1 SH株，继续培养72 h后收集细胞，抽提mRNA，用qPCR检测RdRp基因的转录情况 ，结果可知，两个不同靶点及混合组的Lenti-shRNA-RdRp均能高效敲减DHAV-1 RdRp基因表达，抑制效率达95%以上（图3）。
oadm2.4.2 抑制DHAV-1在细胞中的复制增殖鸭胚成纤维细胞分别转导Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-RdRp-1+2、Lenti-shRNA-NC后，用DHAV-1 SH株分别感染（n=3）。在感染后的24、48、72、96、120 h，分别测定细胞上清液的TCID50，检测结果可知，RdRp 基因沉默后，DHAV-1的复制和增殖效果受到显著抑制，TCID50下降约7lg（图4）。
· 19 ·
第29卷第6期董亚青等：慢病毒介导的siRNA 对１型鸭肝炎病毒复制的抑制作用荧光视野
白光视野
图1 慢病毒对鸭胚成纤维细胞的转导效果
Fig.1 Transduction effect of Lentivirus on duck embryo fi broblasts套利模型
zgbc左图: 绿荧光视野; 右图: 白光下的视野
Left: Green fl uorescent fi eld of vision; Right: White light fi eld of vision
图2 FACS 检测慢病毒对鸭胚成纤 维细胞转导率
Fig .2 FACS detection of transduction rate of Lentivirus on duck embryo fi broblasts
图3 qPCR 检测RdRp 干扰效果
Fig.3 Effect of RdRp interference detected by qPCR
2.5 重组慢病毒抑制DHA V-1在鸭胚中的复制增殖 将重组病毒Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-RdRp-1+2以及对照病毒Lenti-shRNA-NC接种鸭胚2 d后，鸭胚绒毛尿囊膜接种DHAV-1 SH病毒，攻毒后的72 h内Lenti-shRNA-NC组鸭胚全部死亡，其余未见死亡；收集胚体和尿囊液测定TCID 50，相对于阴性对照组，干扰组TCID 50显著下降，约8.2lg（图5）。
未转导病毒对照C o u n t
C o u n t
打电话的教学反思FITC-A subset
3.30
FL1-A: FITC-A FL1-A: FITC-A
FITC-A subset
96.0
Lenti-GFP
120100806040200
R e l a t i v e e x p r e s s i o n
shRNA-NC shRNA-RdRp-1shRNA-RdRp-2shRNA-RdRp-1+2
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中国动物传染病学报3 讨论
鸭病毒性肝炎是严重危害中国养鸭业的禽病之一
[14]
，疫苗免疫是预防该病的重要手段，但由于
DHAV变异及疫苗本身的缺点，临床的防疫效果并不理想，寻求新的防疫方法刻不容缓。RNA干扰技术作为一种新型抗病毒感染策略，已被证实可以在体内外抑制人和动物源病毒的复制，随着双链RNA 合成技术的改进和发展，RNAi在基因功能、信号转导通路、基因、新药开发等领域被广泛应
用[15-16]。RNAi最核心的的内容是小干扰RNA的设计和筛选。RNA聚合酶作为RNA病毒转录和复制过程中的关键酶，是RNA沉默的良好靶基因。
本研究在前期已完成RdRp特异siRNA对应shRNA合成和筛选的基础上，将沉默RdRp效果较好的shRNA1和shRNA2分别克隆入慢病毒载体，进行抑制DHAV复制的研究。在鸭胚成纤维细胞上进行的RdRp 基因沉默，结果显示，Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-RdRp-1+2均能较好的抑制RdRp 基因的表达，病毒感染后72 h，用qPCR检测，三组的抑制效率均在95%以上，混合组Lenti-shRNA-RdRp-1+2的抑制效果与Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2没有明显的
差异。细胞转导干扰质粒48 h后感染病毒，感染后24 h病毒抑制作用就产生，且至少持续了120 h。重组病毒Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2、Lenti-shRNA-RdRp-1+2在鸭胚中也能较好抑制DHAV-1的增殖，相 对于阴性对照组，干扰组TCID 50可显著下降。
综上所述，构建的Lenti-shRNA-RdRp-1、Lenti-shRNA-RdRp-2能有效抑制RdRp 基因的表达及DHAV-1在DEF细胞和鸭胚上的增殖，为鸭病毒性肝炎的防控提供了新思路和方向。
图5 重组病毒对鸭胚中DHAV-1病毒复制的影响
（TCID 50，n =3）
Fig.5
Effect of recombinant virus on replication of DHAV-1
virus in duck embryo (TCID 50, n =3)
11109876543210
病毒T C I D 50
shRNA-NC
学者灵芝shRNA-RdRp-1
shRNA-RdRp-2
shRNA-RdRp-1+2
图4 RdRp 基因沉默对DHAV-1病毒复制的影响（TCID 50, n =3）
Fig.4 Effect of RdRp gene silencing on replication of dhav-1 virus (TCID 50, n = 3)
109876543210
病毒T C I D 50 (l g )
24 h
48 h
72 h 感染时间
shRNA-NC shRNA-RdRp-1shRNA-RdRp-2shRNA-RdRp-1+2
96 h 120 h
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