李建华，王秋香，冼耀强，等．广东省典型地貌高产水田耕作层与犁底层土壤微生物落特征［Ｊ］．江苏农业科学，２０２２，５０（２４）：１８９－１９７． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２２．２４．０２９
广东省典型地貌高产水田耕作层与犁底层
土壤微生物落特征
李建华１，王秋香１，冼耀强２，贾宇航２，李珊珊２，陈 平２，张 晖２
（１．广东省土地开发整治中心，广东广州５１０６３５；２．仲恺农业工程学院，广东广州５１０２２５）
摘要：为研究广东省不同地貌高产水田土壤微生物落特征，以及更好推进垦造水田建设工作。以广东省南雄市、清远市清城区、英德市、惠州市博罗县和惠东区的高产水田耕作层和犁底层土壤为研究对象，函括了山地丘陵区、平原区、丘陵台地区和丘陵地区。比较高产水田土壤有机质含量，利用高通量测序分析土壤中细菌的落组成、多样性及差异性物种。结果表明：（１）耕作层的有机质含量总体上高于犁底层，其中英德市高产水田耕作层有机质含量均高于２４ｇ／ｋｇ，其次是惠东区，平均有机质含量为２０ｇ／ｋｇ；（２）１５块高产水田微生物相对丰度较高的属主要包括拟杆菌属
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、粪杆菌属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ＪＧ３０－ＫＦ－ＡＳ９、毛螺菌属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌａｃｅａｅ、罗斯氏菌属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、亚硝化杆菌属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ＿Ｎｉｔｒｏｓｏｔａｌｅａ）、乳杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、巨单胞菌属（Ｍｅｇａｍｏｎａｓ）；（３）惠东区和博罗县高水田耕作层和犁底层的香农（Ｓｈａｎｎｏｎ）指数、辛普森（Ｓｉｍｐｓｏｎ）指数高于另外３个地区高产水田。清城区高产水田耕作层的多样性指数最低，惠东区、南雄市的耕作层与清城区的耕作层差异性较大，博罗县的耕作层与南雄市的耕作层微生物相似性较高，博罗县的犁底层与惠东区的ＨＤ１Ｌ和ＨＤ２Ｌ相似性高，但与ＨＤ３Ｌ差异性较大。垦造水田的日后建设应以高产水田作为参考，包括综合模式种植的考虑，并在有机质含量和ｐＨ值方面调整，以有利于基于旱地为背景下改造而成的水田土壤中微生物健康落构建。 关键词：水田；微生物；高通量测序；多样性；耕作层；犁底层
中图分类号：Ｓ１５４．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２２）２４－０１８９－０９
haipad收稿日期：２０２１－１２－２８
夏花网基金项目：广东省自然资源厅科技项目（编号：ＧＤＺＲＺＹＫＪ２０２１００３）。作者简介：李
建华（１９７９—），男，山东东明人，博士，高级工程师，从事土地利用调查评价、规划和整治研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｏｍａｏ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ。通信作者：张 晖，博士，助理研究员，从事生态修复及森林培育研究。Ｅ－
ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｈｕｉ＠ｚｈｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 土壤是作物的生长基础，水稻更是全球最主要的粮食作物之一，世界５０％以上的人口以稻米为主食。我国作为世界上最大的水稻生产国，２０２０年全国水丝比论坛
稻种植面积３００７．６万ｈｍ２，总产量２１１８６万ｔ［１］
。
一直以来工业化、城镇化和农业现代化的发展使得用地出现了供求不平衡的现象，如何保护现有耕地、守住耕地红线，成为维护我国粮食安全的战略举措。广东省地形复杂，主要的地形包括平原、山地、丘陵、台地，面积占比分别为３３．７％、２４．９％、
预调微调
２１．７％、１４．２％［２－３］
。进行垦造水田时利用的地块
类型有非水田的旱地、非耕地中的园地、坑塘水面和水浇地。设计和施工包括了土地的平整、灌溉与排水建设、田间道路修建、农田防护与生态环境保
持工程和土壤改良工程［
４］
。水稻田较一般农田的明显区别是其有耕作层和犁底层的土层结构，后者是由耕作时使用的犁底对土壤的物理性压力进而
形成的坚硬土层［５］
，其也与长期大水温灌及降水造成的黏粒沉降的集聚作用有关［６－７］。目前，垦造水
田在“旱改水”中构建犁底层时往往通过重型机械碾
压土层而成［
８］。犁底层的容重则高达２．０ｇ／ｃｍ３
，紧实的犁底层限制了土壤养分的有效性和作物根系
生长［
９］
。在过去２
０年中，土壤生物多样性及其生态系统功能越来越受到关注。地下生物多样性占地球总
生物多样性的９５％，但只有５％的生物被分类［１０］
。
土壤微生物对物质循环发挥的作用包括有机化合
物的降解、土壤养分转化和循环［１１］
。土壤中微生物
从过去的培养基培养、定量分析，到现在的基于ｒＲＮＡ和ｒＤＮＡ分析揭示了部分土壤微生物多样性。微生物生态学的前沿工作将在进化和功能信息分
子系统复合分析中展开［１２］。土壤微生物的落结
构直接与作物的生长存在直接或间接的关系，研究发现，生态集的特性，其优势物种丰度、落多样
性等与作物产量显著相关［１３－１４］。高产水田的质量
除体现在土壤容重、有机质含量、ｐＨ值外，土壤中微生物落结构及多样性均可反映高产水田的土体特征，可为垦造水田向高产水田建设作参考。本试验以广东省５个地区４种地貌高产水田的土壤为研究对象，分析水田土壤耕作层与犁底层细菌微生物落的特征，以期为日后高产水田的建设提供参考。
１ 材料与方法１．１ 研究区域概况
本试验研究区域包括广东省南雄市、清远市清城区、英德市、惠州市博罗县和惠东区。具体的高产水田及地貌信息见表１。取样点分布见图１。
表１ 高产水田地理信息
地貌高产水田位置耕作层代号耕作层组代号
犁底层代号犁底层组代号
山地丘陵区
英德高产水田１（ＹＤ１）大站镇联丰村ＹＤ１ＧＹＤＧＹＤ１ＬＹＤＬ英德高产水田２（ＹＤ２）大站镇联丰村ＹＤ２ＧＹＤＧＹＤ２ＬＹＤＬ英德高产水田３（ＹＤ３）望埠镇桥新村ＹＤ３ＧＹＤＧＹＤ３ＬＹＤＬ南雄高产水田１（ＳＧ１）古市镇古市村ＳＧ１ＧＳＧＧＳＧ１ＬＳＧＬ南雄高产水田２（ＳＧ２）古市镇古市村ＳＧ２ＧＳＧＧＳＧ２ＬＳＧＬ南雄高产水田３（ＳＧ３）
古市镇古市村ＳＧ３ＧＳＧＧＳＧ３ＬＳＧＬ平原区
博罗高产水田１（ＢＬ１）石坝镇蓝新村ＢＬ１ＧＢＬＧＢＬ１ＬＢＬＬ博罗高产水田２（ＢＬ２）石坝镇蓝新村ＢＬ２ＧＢＬＧＢＬ２ＬＢＬＬ博罗高产水田３（ＢＬ３）
石坝镇流洞村ＢＬ３ＧＢＬＧＢＬ３ＬＢＬＬ丘陵台地区
惠东高产水田１（ＨＤ１）梁化镇星湖村ＨＤ１ＧＨＤＧＨＤ１ＬＨＤＬ惠东高产水田２（ＨＤ２）梁化镇星湖村ＨＤ２ＧＨＤＧＨＤ２ＬＨＤＬ惠东高产水田３（ＨＤ３）
梁化镇星湖村ＨＤ３ＧＨＤＧＨＤ３ＬＨＤＬ丘陵地区
清城高产水田１（ＱＣ１）龙塘镇安丰村ＱＣ１ＧＱＣＧＱＣ１ＬＱＣＬ清城高产水田２（ＱＣ２）龙塘镇安丰村ＱＣ２ＧＱＣＧＱＣ２ＬＱＣＬ清城高产水田３（ＱＣ３）
龙塘镇安丰村
ＱＣ３Ｇ
ＱＣＧ
ＱＣ３Ｌ
ＱＣ
Ｌ
１．２ 土壤样品采集
样品采集时间为２０２０年１２月１１日至２０２１年
１月１８日，在每块高产水田里挖取１个深５０～６０ｃｍ的剖面，分析其剖面构型，确定耕作层与犁底
层位置，于剖面旁边进行耕作层与犁底层原状土取样，每层各取３个环刀。采用梅花五点采样法于所调查的高产水田内进行耕作层与犁底层散土取样，样品混合均匀备用。１．３ 主要试剂与仪器
荧光定量基因扩增仪（德国耶拿分析仪器股份公司）；ＮａｎｏＤｒｏｐ超微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）；ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ高通量测序由广州艾基生物技术有限公司完成。１．４ 土壤有机质含量的测定
土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法测定。１．５ 土壤ＤＮＡ提取
取０．５ｇ土壤，使用美国ＭＰ生物医疗公司的ＦａｓｔＤＮＡ ＳＰＩＮＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌｓ试剂盒提取ＤＮＡ，使用ＮａｎｏＤｒｏｐ测定ＤＮＡ的浓度和纯度。１．６ 细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高通量测序
采用十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法对样品的基因组ＤＮＡ进行提取，用琼脂糖凝胶电泳定量检测Ｄ
ＮＡ。以稀释后的基因组ＤＮＡ为模板，根据测序区域的选择，使用特异引物５１５Ｆ（５′－ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ－３′）、８０６Ｒ（５′－ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ－３′）对１６ＳｒＲＮＡ基因的Ｖ３～Ｖ４高变区片段进行聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增。ＰＣＲ反应体系：２×ＰｈｕｓｉｏｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ１５μＬ，正、反向引物（２μｍｏｌ／Ｌ）各３μＬ，基因组ＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）７μＬ，ｄｄＨ２Ｏ２２μ
Ｌ。ＰＣＲ反应条件：９８℃１ｍｉｎ；９８℃１０ｓ，５０℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ。根据ＰＣＲ产物浓度进行等量混样，充分混匀后纯化Ｐ
ＣＲ产物。利用ＭｉＳｅｑ／Ｈｉｓｅｑ平台对１６ＳｒＤＮＡ的１个或多个高变区进行双末端（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ）测序。
１．７ 高通量测序数据分析
测序的原始数据使用ＱＩＩＭＥ２．０和ＵＳＥＡＲＣＨ流程进行分析，序列经拼接、过滤和质控后，操作分类单元（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｔａｘｏｎｏｍｉｃｕｎｉｔ，简称ＯＴＵ）在９７％
相似性水平划分，细菌序列通过与数据库ＳＩＬＶＡ（Ｒｅｌｅａｓｅ１３８，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｂ－ｓｉｌｖａ．ｄｅ）比对确定系统学分类，得到每个样品的ＯＴＵｓ和基本分析结果，同时在各个分类水平上进行组成结构统计和多样性分析。１．８ 统计分析
试验数据采用ＳＰＳＳ２３、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ１４．０、ＷＰＳ、Ｒ－Ｓｔｕｄｉｏ软件进行整理、分析及作图。２ 结果与分析
２．１ 高产水田有机质含量
对１５块高产水田的有机质进行检测，结果（图２）表明，除个别水田如ＱＣ１、ＱＣ３、ＳＧ１和ＳＧ３外，其他高产水田耕作层土壤的有机质含量明显高于犁底层，ＹＤ１、ＹＤ２、ＨＤ２、ＢＬ３的耕作层有机质含量分别为２８．２０、２４ ０８、２４．０８、２９．５８ｇ／ｋｇ，其含量分别为犁底层的３ ４、３．３、２．１、２．０
倍。
２．２ 微生物落分析
３０个样品一共获得１７０３０６１４条序列，经质量控制，单个样品的序列数在１３万～２３７万条，其中获得序列数较低的７个样品分别为ＨＤ３Ｌ、ＨＤ１Ｌ、ＳＧ１Ｇ、ＱＣ３Ｌ、ＨＤ２Ｌ、ＳＧ３Ｌ、ＢＬ３Ｇ，序列数范围在１３万～４１万条，ＨＤ１Ｇ的序列数最高，为２３７万条，其
次则是ＳＧ２Ｇ、ＨＤ３Ｇ、ＱＣ１Ｌ，分别为７８万、７６万、７３万条。同一水田的ＨＤ３Ｇ获得的序列数是其犁底层ＨＤ３Ｌ的７．６倍，并且从总体结果来看同一水田耕作层获得的序列数要高于犁底层。通过对抽平后的扩增子序列变体（ＡＳＶ）数量进行统计，结果（图３）表明，ＡＳＶ数量最多的是ＨＤ１Ｇ，为９５６５个，ＨＤ１Ｌ
只有２２９０个，ＡＳＶ数量较低的为ＳＧ２Ｌ、ＳＧ３Ｌ。ＡＳＶ数量在耕作层和犁底层的表现趋势与获得序列数表现一致。
２．３ 不同微生物分类水平下物种数
通过对抽平后的ＡＳＶ进行分析，统计得到样品的物种注释结果中门、纲、目、科、属、种６个分类水平各自含有的分类单元的数量（图４），总体上耕作层土壤微生物归类单元在各水平上要高于犁底层，
其中ＨＤ１Ｇ共涉及４７３科７３２属３０８种，是所调查的水田样品中最多的，而ＨＤ２Ｇ、ＨＤ３Ｇ分别有４２６科６４４属２５７种、４０３科６１２属２５２种。说明该地区高产水田土壤微生物种类高于另外３个地区。而在犁底层中，ＳＧ２Ｌ、ＳＧ３Ｌ分别只有１６３科２３７属７５种、１９３科２７５属９５种，是所调查土壤样品中含有
霍尔效应微生物种水平下最低的。
以地方为单元进行统计，在属水平下各土层表现如下：
ＢＬＧ有５２５属、ＨＤＧ有６６３属、ＱＣＧ有３０３属、ＳＧＧ有３９８属、ＹＤＧ有４８６属、ＢＬＬ有５２４属、ＨＤＬ有４２２属、ＱＣＬ有４５４属、ＳＧＬ有２８３属、ＹＤＬ有４１８属。ＳＧＬ共鉴定出２８３属，明显低于ＳＧＧ的３９８属；ＨＤＧ与ＨＤＬ相差２４１属；ＢＬＬ与ＢＬＧ的属数相近；但ＱＣＧ则比ＱＣＬ要少１５１属。
在种水平上，
ＳＧＬ鉴定出了９５种，ＳＧＧ为１３４种；最高的为ＨＤＧ，有２７２种，同一地方的ＨＤＬ为１５１种。对各地样品的物种数进行方差比较（图５）可知，
ＢＬＧ与ＢＬＬ、ＳＧＧ与ＳＧＬ、ＹＤＧ与ＹＤＬ之间的差异性不显著，而ＨＤＧ与ＨＤＬ的种数量差异显著。从地区上比较可知，ＨＤＧ和ＢＬＧ要显著高于ＱＣＧ、ＳＧＧ，ＢＬＬ要显著高于ＳＧＬ，但与另外３个地区的犁底层差异不显著。
２．４ 各样品在属水平下的相对丰度比较
在属水平下，相对丰度排前１０名的属包括拟杆菌属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、粪杆菌属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ＪＧ３０－ＫＦ－ＡＳ９、毛螺菌属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）、Ｍｕｒｉｂａｃｕｌａｃｅａｅ科中确定属、罗斯氏菌属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ＿Ｎｉｔｒｏｓｏｔａｌｅａ、乳杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、巨单胞菌属（Ｍｅｇａｍｏｎａｓ）、毛螺菌科未确定属（图６）。从样地来看，
教学植物园
ＢＬ、ＨＤ、ＱＣ和ＳＧ高产水田相对丰度最高的为拟杆菌属，并且ＱＣ１Ｇ、ＱＣ２Ｇ、ＱＣ３Ｇ、ＱＣ３Ｌ、ＳＧ１Ｇ、ＳＧ１Ｌ的拟杆菌属相对丰度分别达到２５ ２４％、２２．６４％、２９．０１％、２４ ３９％、３０．３６％、２６ １０％。但是ＹＤ１Ｇ、ＹＤ２Ｇ、ＹＤ３Ｇ相对丰度最高的则是ＪＧ３０－ＫＦ－ＡＳ９，分别达到１８．２７％、１５ １１％和２２．３３％，而
其犁底层中ＪＧ３０－ＫＦ－ＡＳ９的相对丰度分别为０ ２４％、０．５９％、０．０４％。
２．５ 土壤微生物α多样性指数
由图７、图８可知，在α多样性指数方面，ＱＣＧ的香农（Ｓｈａｎｎｏｎ）指数和辛普森（Ｓｉｍｐｓｏｎ）指数要明显低于其他高产水田土壤多样性，其值分别为６ ８０和０．９７７，但同样地中ＱＣＬ的Ｓｈａｎｎｏｎ指数和Ｓｉｍｐｓｏｎ指数分别为８．４３和０．９７７，后者远高于前者。ＨＤＧ和ＢＬＧ的Ｓｈａｎｎｏｎ指数、Ｓｉｍｐｓｏｎ指数在所检测的１５块高产水田耕作层和犁底层中处于高位，分别为１０．５８、１０．１３和０．９９５、０．９９６
。
２．６ 层次聚类分析
β多样性聚类分析中多采用层次聚类
（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）的分析方法，以等级树的形
式展示样品间的相似度，通过聚类树的分枝长度衡
量聚类效果的好坏。与排序分析相同，聚类分析可
以采用任何距离评价样品之间的相似度。
由图９可知，ＨＤ、ＳＧ的耕作层与ＱＣ的耕作层
差异性较大，ＹＤ的耕作层与ＱＣ１Ｌ、ＱＣ２Ｌ的相似性
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