目的瞭解物質的吸收光譜與比爾定律（Beer’s Law）的光譜分析應用。（參閱緒論部份6-16） 原理光譜學（spectroscopy）是研究物質與電磁輻射（electromagnetic radiation）的交互作用以探討物質的微觀結構，並應用於物質的定性與定量分析的一門學問。電磁輻射又稱為電磁波或光，光譜學的“光”包括了所有肉眼可見與不可見的電磁輻射。光譜的測量有吸收（absorption）與放射（emission）兩種方法。放射光譜法是將待測樣品以各種高能量予以激發後，測量由樣品所釋放出來的電磁波的強度與波長或頻率的對應關係。吸收光譜法則是將電磁波通過待測樣品，然後測量電磁波被吸收的程度與波長或頻率的對應關係。 在吸收光譜法中，通常以透光率（transmittance，符號T）或透光百分率（percent transmission，符號%T）與吸收度（absorbance，符號A），來表示光被吸收的程度。由於“光”被吸收的程度，與其波長或頻率有關，因此以上的三個名詞都是針對特定波長的“光”所定義的。其定義如下：
T = I / I0(1)
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I = 通過樣品後的光強度
I0 = 通過樣品前的光強度
%T = T x 100 (2)
A = –log10（I/I0）= – log10（T）
= log10（100/％T）= 2 – log10（％T）(3)
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(4)
圖1. 光通過試樣的路徑
由以上的定義，可知若光被吸收的程度愈高，則T與%T的數值愈小，而A的數值愈大。通常吸收光譜
儀的讀出計可選擇讀取透光百分率或吸收度。在做定量分析時，我們通常選擇讀取與試樣濃度有直接對應關係的吸收度。然而，因吸收度是對數指標，在高吸收度時所讀取的數值準確度較差，而透光百分率為線性，在整個透光範圍的讀取值具有較好的準確度，因此，當吸收度大於0.7時，我們通常選擇讀取透光百分率，再以式(4)計算出吸收度。 在一定的波長下，吸收度與樣品中吸光物質的濃度之間，有一個簡單的關係式，稱為比爾-朗伯定律（the Beer-Lambert law），簡稱比爾定律。比爾定律通常以“吸收度(A)等於英文前三個小寫字母的乘積”的形式表示：在医院睡了夜班护士
环球纵横A = a⋅b⋅c(5)
其中，b是光穿過樣品的路徑長度，c是樣品中吸光物質的濃度，而a則與樣品在特定的波長下的吸光能力有關，稱為消光係數（extinction coefficient or absorptivity）。通常在分析化學上，b的單位使用cm，c的單位使用mol/L，而a則另以希臘文的小寫字母ε表示（單位為L cm-1 mol-1= M-1cm-1），稱為莫耳消光係數。使用上述特定單位時，比爾定律以下列的形式表示：
A = ε⋅b⋅c(6)
任何物質對於不同波長的光有不同的吸收度，即其消光係數或莫耳消光係數也因波長而異。實驗所得
到的A（或ε或%T）與波長或頻率的對應關係圖就是所謂的吸收光譜（參閱緒論p.33圖十六）。由於各種純物質（化合物與元素）各有其獨特的光譜就像每一個人的指紋一樣，因此由吸收波長的光譜位置可分辨出樣品的成份。即使是不吸收可見光的透明物質，也可以由其紅外光、紫外光等不可見光所得的光譜，予以辨別指認。
對於任一純物質，若根據其光譜特性，選擇適當的固定波長，在一定的溫度與溶劑的件下，其稀溶液的莫耳消光係數(ε)趨近於一常數。測定光譜時，若使用一定規格的方形試液槽（cuvet），則光穿過樣品的路徑長度為一定值；若使用一定規格的圓柱形試液管，則雖然光穿過樣品的路徑長度並非為一定值，但由於大部份光穿過樣品的路徑長度接近試液管的內直徑（參閱緒論p.33圖十五），所以比爾定律中的b仍可視為一常數。
若ε與b均為常數，則根據比爾定律，吸收度A與濃度c成正比。理論上，只要從一已知濃度的標準溶液的吸收度，由A/c即可求得ε與b
的乘積。若ε⋅b為一常數，則對於與標準溶液含有相同吸光物質的溶液，由其吸收度依式（6）就可以得其濃度。然而，一方面考慮到“測量的不準確性”，另一方面由於消光係數在一般的實驗件下並不一定是常數（參閱緒論p.34‘比爾定律的限制’），因此使用比爾定律做定量分析時，必須要先作一檢量曲線圖（calibration curve）。其方法如下：在一定的濃度範圍內製備三或四個不同濃度的標準溶液，
分別測量其在特定波長下之吸收度，以吸收度對濃度作圖，迴歸後即可得到檢量曲線。對於待測溶液，則可由其吸收度根據檢量曲線(以內插法)求得其濃度。
檢量曲線所依據的原理是：在固定波長以及一定的溫度與溶劑的件下，雖然一純物質的莫耳消光係數(ε)在非稀溶液中並非一常數，但只與此一純物質的濃度有關。以數學的觀念說明如下：在使用一定規格的試液槽或試液管的件下b為一常數，比爾定律可以函數f表示，A = f(ε，c) = ε⋅b⋅c；當ε只與濃度有關，兩者的關係可以函數g表示，ε= g(c)；將g 代入f，f則成為c的複合函數也可表為c的簡單函數F，A = f[g(c)，c] = F(c)，即吸收度與濃度間存在著一對一的關係。在本實驗以及下一個實驗中，我們所測量的都是比較稀薄的溶液之吸收度，所得到的檢量曲線可能都會接近直線。但是，檢量曲線即使為非線性，或是由於儀器的因素沒有通過原點，只要圖形具再現性，仍可被用來做為定量分析之用。
在本實驗中我們將使用硝酸亞鈷水溶液，先測定其可見光的光譜，再由光譜選擇適當的固定波長，即光譜中吸收度最高值的對應波長（參閱緒論p.35圖十七及p.34-35的文字說明），然後由已知濃度的標準溶液作出硝酸鈷水溶液的檢量曲線圖。
器材單束分光光度計(如圖2.)(Milton Roy SP-20或其他廠牌型號)，光度計試液管，試管，試管架，50 mL燒杯，50 mL量筒，滴管，10 mL量筒
藥品0.200 M Co(NO3)2 水溶液，蒸餾水
圖2. 單束分光光度計(左：指針型，右：數字型)
實驗步驟
发展动向
A. 測定Co(NO3)2水溶液的光譜
1. 以量筒取0.200 M Co(NO3)2水溶液15 mL置於50 mL燒杯內。
2. 取兩支相同(規格)的試液管，其中一支加入約2/3滿的蒸餾水當做“空白試
液”（緒論p.35-36）。
3. 將波長調整鈕調到390 nm。
校正歸零:
7. 取另一支試液管，先以少量的0.200 M Co(NO3)2水溶液漱洗兩次，再加入
2/3滿的0.200 M Co(NO3)2水溶液(所有乾淨的0.200 M Co(NO3)2溶液都可留待步驟B使用)。
8. 將樣品試液管(步驟7)插入樣品槽，注意試液管上的線與樣品槽內的參考
記號對齊。關上樣品槽，讀取A。若使用的分光光度計為指針型，則A 在0.7以下，可直接讀取A，A在0.7以上，則選擇讀取%T，再依公式將%T換算成A。若使用的分光光度計為數字型，則直接讀取螢幕上的A值即可。取出樣品試液管以供步驟9使用。
9. 每次以波長調整鈕調增波長10 nm，由400到600 nm，依步驟4 ~ 6校正
歸零，然後再以樣品試液管，依步驟8操作，讀取A。
10. 將所讀取的%T以式(4)計算出吸收度，連同直接讀取的吸收度A以吸收
度（A）對波長（λ）作圖，並決定出最大吸收度的對應波長。
11. 將樣品試液管中0.200 M Co(NO3)2水溶液倒回步驟1的50 mL燒杯內，
以供步驟B使用。
B. 檢量曲線
1. 取四支乾淨的普通試管並標號1到4，置於試管架上。
2. 以10 mL量筒分別量取7.00，5.00，4.00及2.00 mL的蒸餾水，依序注入
在試管架上的四支試管。
3. 以10 mL量筒分別量取0.200 M Co(NO3)2水溶液(步驟A.11)1.00，3.00，
4.00及6.00 mL，依序注入試管，使每支試管均有8.00 mL的溶液並攪拌
混合均勻。（如下表所示）
4. 計算每支試管中，Co(NO3)2的濃度，填入結果C的表格中。
5. 將波長調整鈕調到步驟A.10所得的最大吸收度對應波長，並用空白試液
(步驟A.2)，依步驟A.4 ~ 6校正歸零。
6. 先以蒸餾水漱洗試液管，再用少量最稀濃度溶液(1號試管) 漱洗兩次後，
加入2/3滿的1號試管溶液，測量其A。
7. 依序由稀到濃(2，3，4號試管)，按前一步驟測量A。
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8. 以1至4號溶液所得的吸收度A對Co(NO3)2的濃度C，加上步驟A 0.200
M溶液的吸收度，共5點作圖。由實驗的5點數據加上原點畫出一最好的直線即為硝酸亞鈷水溶液的檢量曲線。
* (若以實驗的5點數據不加上原點，以電腦套裝軟體迴歸，可以得到較準確的非線性檢量曲線。)
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