茅广军
佚 名
【摘 要】血凝-血凝抑制(HA-HI)试验是鉴定病毒及检测相应抗体常用的检测方法之一,是兽医实验室人员必须掌握的试验技能,主要应用于家禽H5N1/H7N9型禽流感、鸡新城疫的免疫效果评估.试验中根据血凝(HA)试验的终点判定,正确计算和配制四单位(4HAU)抗原是直接影响试验成败的关键,配制4HAU抗原后需进行抗原回滴验证,确保血凝抑制(HI)试验结果无误.
【期刊名称】《湖南畜牧兽医》
【年(卷),期】2018(000)006
【总页数】克曼模型3页(P47-49)
【关键词】四单位抗原;抗原回滴;血凝-血凝抑制试验;鸡禽流感抗体检测
【正文语种】中 文
【中图分类】S851.4
在HA-HI试验操作过程中，应准备好试验试剂、器材，按照试验步骤，提前配制好阿氏液、PBS液、1%鸡红细胞、病毒抗原、阳性血清，在完成HA试验后仔细观察抗原的最高稀释倍数，根据观察结果计算配制出4HAU抗原，HI试验与抗原回滴验证依次进行，抗原回滴验证结果出现抗原少、太少或太多的问题，则配制4HAU抗原环节出现误差，抗原回滴情况好则HI试验成功。
1 试验准备
1.1 试剂
禽流感病毒H5亚型（Re-8株）血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验阳性血清、PBS干粉、柠檬酸钠。
1.2 器材
分析天平、超纯水仪、离心机、微量振荡器、注射器、离心管、三角烧杯、移液器及吸头、96孔V型微量反应板。
1.3 阿氏液配制
称3.8g柠檬酸钠于三角烧杯中，加蒸馏水100mL。
1.4 PBS液配制
按PBS干粉说明配制出1 000 mL PBS缓冲液。
1.5 1%鸡红细胞悬液制备
取十分之一阿氏液于注射器中，采SPF公鸡血混匀。用10倍血量的PBS液洗涤3次（高速离心），抽干清液，如SPF公鸡血量为1mL，则加30 mL PBS液，如SPF公鸡血量为2 mL，则加60 mL PBS液，以此类推。
1.6 病毒抗原、阳性血清
按试剂要求加入蒸馏水2 mL。
2 血凝（HA）试验操作
①在96孔V型微量反应板的1至12孔加入25 μLPBS液，更换吸头。
②做A、B两排重复，吸取25μL病毒抗原加入第1孔，混匀，倍比稀释到第11孔，11孔吸取25μL弃之。
③每孔加入25μLPBS液。
④每孔加入25μL1%鸡红细胞悬浮液。
2.1 观察结果
振荡混匀，在室温20℃～25℃下静置30min后，观察和记录结果。
2.2 结果判定
将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状态。完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。
3 配制4HAU抗原方法
3.1 方法一
precis
用PBS液作稀释，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点（图1），终点稀释倍数除以4即为含四单位的抗原的稀释倍数。例1，血凝的终点滴度为256，则4HAU抗原的稀释倍数应是64倍（256÷4=64，即4HAU抗原=1mL抗原+63mLPBS液）；例2，血凝的终点滴度为512，则4HAU抗原的稀释倍数应是128倍（512÷4=128，即4HAU抗原=1 mL抗原+127 mLPBS液）。
3.2 方法二
以完全血凝的病毒最高稀释倍数向前推2个滴度为四个血凝单位，图1中例2为9-2=7，即1：128倍稀释，以此稀释倍数所配抗原即为4HAU抗原。
图1 配制4HAU抗原
4 血凝抑制（HI）试验操作步骤
①在96孔V型微量反应板的1至12孔加入25μLPBS液，更换吸头。
②（阳性血清A、B两排）吸取25μL阳性血清加入第1孔，混匀，倍比稀释到第11孔，11孔吸取25μL弃之。
③ （待检血清 C、D、E、F、G、H 六排） 吸取25μL待检血清加入第1孔，混匀，倍比稀释到第11孔，11孔吸取25μL弃之。
獭兔行情预测④每孔加入25μL4HAU抗原。
⑤做抗原回滴对照[2]
1）做二排抗原回滴，在两排的第1～8孔各加25μL PBS液，取4HAU抗原25μL加在两排的第1、2孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第4孔，弃去25μL，另一排同样。
2）从第2至第8孔补25μLPBS液，以保持75μL总量不变，另一排同样。
ca1303）两排的第1至第8孔各加25μL 1%红细胞，震荡10S。静置30min观察结果。
4）这样在第1孔为四单位抗原，第2孔为二单位抗原，第3孔为一单位抗原，第4孔为二分之一单位抗原，均为75μL总量。
5）第5至第8孔为空白对照。
6）抗原回滴效果评价（如图2）
图2 抗原回滴效果评价[2]A、B效果好，C太多，D少，E太少
⑥振荡混匀，盖板，在室温20℃～25℃下静置30min。
⑦每孔加入25μL1%鸡红细胞，置微量振荡器上轻轻混匀，室温20℃～25℃，静置30min观察和记录结果。
5 注意事项
①尽量做到无菌操作。②准确配制1%鸡红细胞液。③按照说明溶解冻干的试剂。④正确做好HA试验终点判定。⑤正确计算配制4HAU抗原。⑥进行抗原回滴验证。
6 结论
HA-HI试验前必须注重个人防护。前期操作HA-HI试验，要熟练掌握各种试剂溶液的配制方法，对试验全过程有一个清晰的了解。中期需要对试验中的难点进行剖析，如观察判定HA试验的最高稀释倍数、配制4HAU抗原及抗原回滴验证等，不管用哪种方法在解决难点之后，都可以根据经验来判定HA试验最高稀释倍数，正确配制4HAU抗原是做好HI试验的前
提，也是做好家禽免疫抗体检测的基础。从事检测工作需要对每一个试验环节做到认真细致，在试验中学习，善于总结难点，争取每一次的成功试验。
【相关文献】
[1]中华人民共和国国家标准.高致病性禽流感诊断技术：GB/T 18936-2003[S].北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,2003.
[2]蔡文杰,邱立新,邱美珍,等.血凝和血凝抑制试验常见问题及解决方法[J].湖南畜牧兽医,2012,(5)：39～41.
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