有机磷阻燃剂ＴＤＣＩＰＰ对雌性大鼠甲状腺的潜在毒性作用
孙景然１，樊祢祢１，张 桢２，吴 瑾１，韩殿鹏１，白家磊１，杜连１，房彦军１△（１．军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津３０００５０；２．中北大学材料科学与工程学院，山西太原０３００５１）
【摘要】 目的：研究磷酸三（１，３ 二氯 ２ 丙基）酯（ＴＤＣＩＰＰ）对雌性大鼠甲状腺系统的潜在毒性作用及机制。方法：将３２只离乳３周的雌性ＳＤ大鼠随机分为对照组（玉米油灌胃）及ＴＤＣＩＰＰ低、中、高剂量组（５０、１００、２５０ｍｇ／ｋｇ·ｄ，溶于玉米油）（ｎ＝８），灌胃给药２１ｄ，每天１次。于末次给药后处死动物，取血和甲状腺、肝脏，检测血清中促甲状腺激素（ＴＳＨ）、三碘甲腺原氨酸（Ｔ３），甲状腺素（Ｔ４）和游离甲状腺素（ＦＴ４）水平变化；组织切片（ＨＥ染）用于检测甲状腺形态学病变；ＲＴ ＰＣＲ技术与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测与甲状腺功能相关的基因和蛋白表达的变化。 结果：与对照组比较，ＴＤＣＩＰＰ染毒后大鼠甲状腺出现滤泡排列不规则、胶质变少、滤泡增生、肥大等现象，ＴＤＣＩＰＰ低剂量组的血清ＴＳＨ水平和高剂量组的Ｔ３水平均显著升高（Ｐ＜０．０５），低剂量组促甲状腺激素受体（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡ表达和中、高剂量组甲状腺激素受体β（ＴＲβ）蛋白表达均显著降低（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），中、高剂量组甲状腺过氧化物酶
（ＴＰＯ）ｍＲＮＡ表达显著增高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），三个剂量组尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（ＵＧＴｓ）、细胞素氧化酶 ３Ａ１（ＣＹＰ３Ａ１）蛋白表达水平显著上调（Ｐ＜０．０５）。结论：大鼠暴露在５０ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）以上剂量的ＴＤＣＩＰＰ，即可以刺激甲状腺组织的增生，改变血清中甲状腺素的水平，干扰甲状腺的功能，表现出对甲状腺的毒性作用。
【关键词】 磷酸三（１，３ 二氯 ２ 丙基）酯（ＴＤＣＩＰＰ）；大鼠；毒性作用；甲状腺；甲状腺素
【中图分类号】Ｒ１１４ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２０）０３ ２５０ ００５
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５９７９．２０２０．０５５
ＰｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆＴＤＣＩＰＰｏｎｔｈｅｔｈｙｒｏｉｄｉｎｆｅｍａｌｅＳＤｒａｔｓＳＵＮＪｉｎｇ ｒａｎ１，ＦＡＮＭｉ ｍｉ１，ＺＨＡＮＧＺｈｅｎ２，ＷＵＪｉｎ１，ＨＡＮＤｉａｎ ｐｅｎｇ１，ＢＡＩＪｉａ ｌｅｉ１，
ＤＵＬｉａｎ ｑｕｎ１，ＦＡＮＧＹａｎ ｊｕｎ１△
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌＭｅｄ
ｉｃｉｎｅ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００５０；２．ＭａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅ，
ＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎａ，Ｔａｉｙｕａｎ０３００５１，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＴｒｉｓ（１；３ ｄｉｃｈｌｏｒｏ ２ ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＤ ＣＩＰＰ）ｏｎｔｈｙｒｏｉｄｉｎｆｅｍａｌｅＳＤｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｉｒｔｙ ｔｗｏ３ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄｆｅｍａｌｅＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ（ｔｒｅａ ｔｅｄｗｉｔｈｃｏｒｎｏｉｌ），ａｎｄｌｏｗ／ｍｏｄｅｒａｔｅ／ｈｉｇｈ ｄｏｓｅｇｒｏｕｐｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＴＤＣＩＰＰ（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｉｎｃｏｒｎｏｉｌ）（ｎ＝８）．ＡｌｌｒａｔｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｒｎｏｉｌｏｒＴＤＣＩＰＰ（５０，１００，２５０ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））ｏｎｃｅａｄａｙｄｕｒｉｎｇａ２１ ｄａｙｐｅｒｉｏｄ．Ａｌｌｒａｔｓｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄａｆｔｅｒｔｈｅｌａｓｔａｄｍｉｎｉｓｔｒａ ｔｉｏｎ．Ｓｅｒｕｍｔｈｙｒｏｉｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ（ＴＳＨ），３，３’，５ ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（Ｔ３），３，３’，５，５’ ｔｅｔｒａｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（Ｔ４），ｆｒｅｅ３，３’，５，５’ ｔｅｔｒａｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（ＦＴ４）ｗｅｒｅｄｅ
ｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈＥＬＩＳＡｋｉｔ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｙｒｏｉｄｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎ（ＨＥ）ｓｔａｉ ｎｉｎｇ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｇｅｎｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｗｉｔｈｔｈｙｒｏｉｄｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｂｙｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｙｒｏｉｄｓｈｏｗｅｄｆｏｌｌｉｃｌｅｓｉｒｒｅｇｕｌａｒａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ，ｈｙｐｏｃｏｌｌｏｉｄ，ａｎｄｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａｉｎＴＤＣＩＰＰｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｓｅｒｕｍＴＳＨｉｎｌｏｗ ｄｏｓｅＴＤＣＩＰＰｇｒｏｕｐａｎｄＴ３ｉｎｈｉｇｈ ｄｏｓｅＴＤ ＣＩＰＰｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｙｒｏｉｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＳＨＲ）ｍＲＮＡｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙｉｎｌｏｗ ｄｏｓｅＴＤＣＩＰＰｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｙｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＴＰＯ）ｍＲＮＡｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｎｏ ｔａｂｌｙｉｎｍｏｄｅｒａｔｅａｎｄｈｉｇｈ ｄｏｓｅＴＤＣＩＰＰｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＴＲβｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅ ｃｒｅａｓｅｄｓｉｇ
ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｍｏｄｅｒａｔｅａｎｄｈｉｇｈ ｄｏｓｅＴＤＣＩＰＰｇｒｏｕｐｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｕｄｐ ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（ＵＧＴｓ）ａｎｄｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０ ３Ａ１（ＣＹＰ３Ａ１）ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｎｏｔａｂｌｙｉｎＴＤＣＩＰＰｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ５０ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）ＴＤＣＩＰＰｃａｎｃａｕｓｅｔｈｙｒｏｉｄｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ｃｈａｎｇｅｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄｄｉｓｔｕｒｂｔｈｙｒｏｉｄｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｈａｓｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｔｈｙｒｏｉｄ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】 ＴＤＣＩＰＰ； ｍｏｕｓｅ； ｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔ； ｔｈｙｒｏｉｄ； ｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ
【基金项目】后勤科研重大项目（ＡＷＳ１８Ｊ００４，ＢＷＳ１７Ｊ０２５）；
军事医学创新工程专项课题（１７ＣＸＺ００６）
【收稿日期】２０１９ １１ ２５【修回日期】２０２０ ０４ ２２
△【通讯作者】Ｔｅｌ：０２２ ８４６５５０６０；Ｅ ｍａｉｌ：ｆａｎｇｙｊ８６＠１２６．ｃｏｍ．＋：并列第一作者 随着溴代阻燃剂（ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄｆｌａｍｅｒｅｔａｒｄａｎｔｓ，ＢＦＲ）在全球范围内的限制使用，作为替代品的三（２ 氯乙基）磷酸酯（ｔｒｉｓ（２ ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＴＤＣＩＰＰ）有机磷酸脂阻燃剂，已被多个生产领域中广泛应用［１］。有研究已经发现在水、大气、土壤、室
０
５
２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２０，３６（３）
内灰尘等各类环境介质中，甚至人类尿样、脂肪组织、乳汁中均可以检测到ＴＤＣＩＰＰ［１，２］。目前环境中ＴＤＣＩＰＰ的暴露浓度已经开始危害人类的健康，越来越多的调查显示，有机磷酸酯类阻燃剂由于其不易降解、容易在生物体内富集等原因，已经开始威胁到生态环境的安全及人类的健康，相关研究发现该类新型阻燃剂具有内分泌毒性、甲状腺毒性、神经毒性和潜在致癌性［２］。本研究采用经口灌胃的体内染毒方式建立ＴＤＣＩＰＰ暴露动物模型，通过检测甲状腺组织的病理变化及甲状腺激素水平的改变来探讨ＴＤＣＩＰＰ对甲状腺的毒性作用，为更好的评价ＴＤＣＩＰＰ毒性作用机制提供理论支持。
１ 材料与方法
１．１ 动物与分组
读者寄语
将３２只离乳３周的雌性ＳＤ大鼠随机分为４组：对照组（玉米油灌胃）、ＴＤＣＩＰＰ溶解于玉米油中，分为低剂量组（５０ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））、中剂量组（１００ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））、高剂量组（２５０ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）），每组８只，连续灌胃给药２１ｄ，每天１次。末次给药后处死动物，取血后分别取出甲状腺和肝组织备用。１．２ 仪器与试剂
光学显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ，日本），低温高速冷冻离心机（ＡＳＯＮＥ，日本），ＰＣＲ扩增仪（ＡＢＩＰｒｉｓｍ，ＵＳＡ），ＡＢＩ７３００荧光定量ＰＣＲ仪（ＡＢＩＰｒｉｓｍ，ＵＳＡ），紫外凝胶成像系统（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ，ＵＳＡ）；甲状腺激素ＴＴ３、ＴＴ４、ＦＴ４、ＴＳＨ试剂盒（北京北方生物研究所，中国），ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅＤＮａｓｅＩ试剂盒（ＴａＫａＲａ，日本），ＢＣＡ蛋白定量试剂盒（碧云天，中国），ＴＤＣＩＰＰ（Ｓｉｇ ｍａ美国），兔抗ＣＹＰ３Ａ１抗体、兔抗ＵＧＴ１Ａ６抗体、兔抗ＴＴＲ抗体、兔抗ＴＲβ抗体（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）
１．３ 甲状腺脏器系（指）数测定
动物处死后，立刻摘除甲状腺，生理盐水冲洗干净后用滤纸吸干残留液体并称重记录。质量都精确到０．１ｇ。甲状腺绝对质量＝甲状腺质量／动物质量１．４ 甲状腺组织的病理变化
甲状腺被摘除后，用１０％的福尔马林液体固定至少４８ｈ，然后用石蜡包埋，切片厚度约为４～５μｍ，用苏木素和伊红进行染，光学显微镜下观察病理改变并拍照。
１．５ 甲状腺激素的改变
在末次给药结束后，用７％的水合氯醛（注射剂量为０．３ｍｌ／１００ｇ）腹腔注射麻醉动物，主动脉取血，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液于 ８０℃冷冻。血清三碘甲腺原氨酸（３，３’，５ ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ，Ｔ３），四碘甲腺原氨酸（３，３’，５，５’ ｔｅｔｒａｉｏｄｏｔｈｙｒｏ ｎｉｎｅ，Ｔ４），游离Ｔ４（ｆｒｅｅ３，３’，５，５’ ｔｅｔｒａｉｏｄｏｔｈｙｒｏ ｎｉｎｅ，ＦＴ４）和促甲状腺激素（ｔｈｙｒｏｉｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒ ｍｏｎｅ，ＴＳＨ）浓度使用大鼠特异的ＥＬＩＳＡ酶联免疫试剂盒进行测量。
１．６ ＲＮＡ提取和ＲＴ ＰＣＲ分析
称取适量的甲状腺组织，加入液氮和一定比例的ＴＲＩＺＯＬ试剂研磨。４℃离心机，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上层无水相层（含ＲＮＡ）再加入等体积异丙醇，１２０００ｒ／ｍ
ｉｎ离心１０ｍｉｎ后获取ＲＮＡ。用１ｍｌ７５％乙醇清洗ＲＮＡ沉淀１次后用２０μｌＤＥＰＣ水溶解，置于 ８０℃冰箱保存备用。提取的ＲＮＡ纯度和质量分别利用紫外分光光度计测量Ａ２６０／２８０ｎｍ波长吸光值比值和ＥＢ染的１％的琼脂糖凝胶电泳实验验证。第一链ｃＤＮＡ合成使用ＴａＫａＲａ公司的ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ试剂盒，按照试剂盒说明使用。ＲＴ ＰＣＲ使用ＳＹＢＲＲｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲＭａｓ ｔｅｒ Ｍｉｘ Ｐｌｕｓ试剂盒以及ＡＢＩ７３００ＰＣＲ仪器进行，反应体系配备和反应过程详见说明书。所有ＲＴ ＰＣＲ数据均使用２ ΔΔＣＴ方法进行处理。目的基因引物序列如表１所示。
Ｔａｂ．１ ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｆｏｒＲＴ ＰＣＲ
Ｇｅｎｅｎａｍｅ
ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＧＡＰＤＨＮＭ＿０１７００８Ｆ：５＇ ＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡ ３＇
Ｒ：５＇ ＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧ ３＇
ＴＧＮＭ＿００１２７０７８４Ｆ：５＇ ＡＧＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＴＡ ３＇
Ｒ：５＇ ＡＧＴＧＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡ ３＇
ＮＩＳＮＭ＿０５２９８３Ｆ：５＇ ＡＴＣＡＧＧＧＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＣ ３＇
Ｒ：５＇ ＣＧＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣ ３＇
ＴＳＨＲＮＭ＿０１２８８８Ｆ：５＇ ＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＧＴＣＴＴＧ ３＇
Ｒ：５＇ ＡＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＡ ３＇
ＴＰＯＮＭ＿０１９３５３Ｆ：５＇ ＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡ ３＇
Ｒ：５＇ ＴＧＧＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡ ３＇
ＵＧＴ１Ａ６ＮＭ＿０５７１０５Ｆ：５＇ ＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡ ３＇
中大客车
Ｒ：５＇ ＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣＡＡＧＣＡＴＧＴＧ ３＇
ＵＧＴ１Ａ１ＮＭ＿０１２６８３Ｆ：５＇ ＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＧ ３＇
Ｒ：５＇ ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡ ３＇
ＣＹＰ３Ａ１ＮＭ＿０１３１０５Ｆ：５＇ ＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣ ３＇
Ｒ：５＇ ＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＡ ３＇
ＤＩＯ１ＮＭ＿０２１６５３Ｆ：５＇ ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＧ ３＇
Ｒ：５＇ ＴＴＧＴＡＧＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＴＴＡ ３＇
ＴＴＲＮＭ＿０１２６８１Ｆ：５＇ ＴＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＡＴＴＧ ３＇
Ｒ：５＇ ＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡ ３＇
ＴＲαＮＭ＿００１０１７９６０Ｆ：５＇ ＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＧＴＴＡＴＣＡＣＴＡＣ ３＇
Ｒ：５＇ ＧＡＴＣＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣＡ ３＇
ＴＲβＮＭ＿０１２６７２Ｆ：５＇ ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＴＣＡＣ ３＇
Ｒ：５＇ ＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣ ３＇
１
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CHILDRENUNDERTHEAGEOF10２
中国应用生理学杂志，２０２０，３６（３）
１．７ 蛋白提取和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ电泳
新鲜肝脏组织（２００ｍｇ）液氮研磨，加入含有蛋白酶抑制剂ＰＭＳＦ的组织裂解液ＲＩＰＡ试剂进行匀浆裂解。然后在４℃离心１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。蛋白浓度使用碧云天公司的ＢＣＡ蛋白定量试剂盒进行定量。定量后的蛋白样品加入１／５样品体积的６×ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８），１００℃煮沸１０ｍｉｎ。４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，静置备用。经电泳、转膜、洗膜后，抗体孵育（抗体种类见１．２）后，在暗室中进行显。使用紫外凝胶成像系统（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ，ＵＳＡ）进行成像分析。
１．８ 统计学处理
数据均以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，采用ＳＰＳＳ２１．０统计软件进行数据分析，使用Ｌｅｖ
ｅｎｅ’ｓ算法进行方差齐性检验，用单因素方差分析法（ＡＮＯＶＡ）结合Ｔｕｋｅｙ’ｓ检验用来比较对照组与各实验组之间统计学差异。
２ 结果
２．１ 大鼠体重和甲状腺组织质量的变化
与对照组比较，各个ＴＤＣＩＰＰ剂量组大鼠的体重无明显变化。称取甲状腺组织获得其绝对质量，通过公式甲状腺相对质量＝甲状腺绝对质量／大鼠质量，在中剂量组和高剂量组，大鼠甲状腺的绝对和相对质量出现明显的增大，且呈剂量依赖性变化（Ｐ＜０．０５，表２）。
Ｔａｂ．２ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｒａｔｓ’ｂｏｄｙａｎｄｔｈｙｒｏｉｄｗｅｉｇｈｔ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
ＧｒｏｕｐＢｏｄｙｗｅｉｇｈｔ
（ｇ）
Ｔｈｙｒｏｉｄｗｅｉｇｈｔ
（ｇ）
Ｔｈｙｒｏｉｄｒｅｌａｔｉｖｅ
ｗｅｉｇｈｔ（％）
Ｃｏｎｔｒｏｌ１３６．１±１０．４０．０１１±０．００２０．００８±０．００３５０（ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））１３５．２±１３．６０．０１１±０．００３０．００８±０．００２１００（ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））１２５．９±１１．４０．０１３±０．００２ ０．０１０±０．００２ ２５０（ｍｇ／（ｋｇ·ｄ））１１９．９±１６．３０．０１６±０．００５ ０．０１３±０．００４ Ｐ＜０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
２．２ 甲状腺的组织病理变化
ＨＥ染结果可以发现ＴＤＣＩＰＰ染毒组大鼠甲状腺出现不同程度的病理损伤。在对照组中，甲状腺滤泡由立方形上皮细胞组成并充满胶质，所有滤泡细胞均整齐规则排列。低剂量组组织学未出现明显变化。而中、高剂量组大鼠的甲状腺组织切片中，滤泡细胞排列不规则，胶质较少，滤泡有增生和肥大现象，尤其是高剂量组中，滤泡增生严重，部分甚至缺少胶质。四组甲状腺细胞核均未见有异常病变（图１）。Ｆｉｇ．１ ＣｈａｎｇｅｓｏｆｒａｔｓｔｈｙｒｏｉｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＤＣＩＰＰ（ＨＥ×４００）
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｂ：５０ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）ｇｒｏｕｐ；Ｃ：１００ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）ｇｒｏｕｐ；Ｄ：２５０ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）ｇｒｏｕｐ
２．３ 甲状腺激素的变化
血清ＴＳＨ水平在低剂量组ＴＳＨ的平均水平明显低于对照组（Ｐ＜０．０５），中剂量组与高剂量组ＴＳＨ未出现明显变化，Ｔ３在高剂量组水平显著升高（Ｐ＜０．０５），其他各组与对照组相比均无统计学差异。三个ＴＤＣＩＰＰ暴露组中血清Ｔ４和ＦＴ４水平与对照组相比均无统计学差异（图２）
。
Ｆｉｇ．２ ＣｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｙｒｏｘｉｎｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＤＣＩＰＰ（ｎ＝８） Ｐ＜０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
２．４ 与甲状腺激素相关基因表达的变化
利用ＲＴ ＰＣＲ技术检测与甲状腺激素合成及转运相关的１１个基因。其中有４个与甲状腺激素合成相关的基因：钠碘转运体（ｓｏｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅｓｙｍｐｏｒｔ ｅｒ，ＮＩＳ），甲状腺过氧化物酶（ｔｈｙｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＴＰＯ），甲状腺球蛋白（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｔｇ）和促甲状腺激素受体（ｔｈｙｒｏｉｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＳＨＲ）作为目的基因来研究ＴＤＣＩＰＰ暴露是否能够影响大鼠甲状腺激素合成。结果显示：与对照组比较，三个ＴＤＣＩＰＰ暴露组中ＴＰＯｍＲＮＡ水平的表达
２
５
２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２０，３６（３）
均高于对照组，其中中、高剂量组有统计学差异（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。ＮＩＳ和ＴＧｍＲＮＡ表达在低、中剂量组无明显差异，但在高剂量暴露组，二者表达显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）。ＴＳＨｒ基因表达在低剂量暴露组明显下调（
Ｐ＜０．０１），而在中剂量和高剂量组，ＴＳＨＲ表达却呈现出恢复到对照水平的趋势（图３）
。
Ｆｉｇ．３ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｔｈｙｒｏｉｄｔｉｓｓｕｅｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙＴＤＣＩＰＰ（ｎ＝８
）ＮＩＳ：Ｓｏｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅｓｙｍｐｏｒｔｅｒ；ＴＰＯ：Ｔｈｙｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ｔｇ：Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；ＴＳＨｒ：Ｔｈｙｒｏｉｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｒｅ ｃｅｐｔｏｒ
Ｐ＜０．０５，
Ｐ＜０．０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
有７个甲状腺激素转运基因：转甲状腺素蛋白（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ，ＴＴＲ）、甲状腺激素生物基因转化脱碘酶１（ｔｙｐｅ１ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ，ＤＩＯ１）、排泄基因（ｕｄｐ ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １Ａ１，
１Ａ６；
ＵＧＴ１Ａ１，
ＵＧＴ１Ａ６），甲状腺激素受体（ＴＲα和ＴＲβ）以及毒物代谢基因ＣＹＰ４５０３Ａ１（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０ ３Ａ１）被选为目的基因用于研究Ｔ
ＤＣＩＰＰ暴露对大鼠甲状腺功能的影响。在被测的７个目的基因中，仅有４个基因出现有意义的改变。与对照组相比，ＣＹＰ３Ａ１基因和Ｕ
ＧＴ１Ａ６基因在三个暴露组显著上调，尤其在高剂量组明显，两基因分别上调３．７倍和２．３倍（Ｐ＜０．０５）。ＤＩＯ１基因的表达在高剂量组上调１．６倍（Ｐ＜０．０５）。ＴＲβｍＲＮＡ表达水平均低于对照组，但只有在高剂量组才具有统计学意义，下调约５１％（Ｐ＜０．０５，图４）。另外三个目的基因（ＵＧＴ１Ａ１，ＴＴＲ，ａｎｄＴＲα
）
均未发现有意义的改变。Ｆｉｇ．４ ＣｈａｎｇｅｓｏｆｇｅｎｅｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｗｉｔｈｔｈｙｒｏｉｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＤ
ＣＩＰＰ（ｎ＝８）
锚杆钻孔ＵＧＴ１Ａ１，ＵＧＴ１Ａ６：ｕｄｐ ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １Ａ１，
１Ａ６；ＣＹＰ３Ａ１：Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０ ３Ａ１；ＤＩＯ１：Ｔｙｐｅ１ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ；ＴＴＲ：Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ；ＴＲ：Ｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｒｅ ｃｅｐｔｏｒ
Ｐ＜０．０５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
２．５ 与甲状腺素相关蛋白的改变
运用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测肝脏与甲状腺素生成相关的四个目的蛋白（ＴＲβ，ＴＴＲ，ＵＧＴ１Ａ６ａｎｄＣＹＰ３Ａ１），选用ＧＡＰＤＨ为内参蛋白。实验结果表明，与对照组比较，肝脏组织中ＴＲβ蛋白表达呈现剂量依赖性下降趋势，中、高剂量组ＴＲβ蛋白表达分别下降０．８３倍和０．６５倍，且具有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。与ＴＲβ蛋白表达趋势相反，
肝脏组织中Ｕ
ＧＴ１Ａ６和ＣＹＰ３Ａ１蛋白表达水平呈现出有统计学意义的剂量依赖性上调趋势。与对照相比，其中ＵＧＴ１Ａ６分别上调１．４、１．６５和１．８倍，ＣＹＰ３Ａ１分别上调１．４、２．４和３．３倍，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。ＴＴＲ蛋白表达并未发现有统计学意义变化（图５）。
３ 讨论
甲状腺是人体最大的内分泌腺体，具有维持调节人体正常体温、促进发育、调节物质代谢等作用。因此，甲状腺结构及功能的改变会涉及到体内甲状
腺激素水平的变化，从而影响正常的集体功能［３］
。
３
５２中国应用生理学杂志，２０２０，３６（３）
Ｆｉｇ．５ ＣｈａｎｇｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｗｉｔｈｔｈｙｒｏｉｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＤＣＩＰＰｉｎｒａｔｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅ（ｎ＝８）
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
本研究结果表明在ＴＤＣＩＰＰ的暴露下，低剂量组血清ＴＳＨ水平明显降低，导致甲状腺激素分泌减少，从而引起血清中Ｔ３，Ｔ４水平下降趋势。然而血清ＴＳＨ水平在高剂量组又明显升高。可能是由于低剂量ＴＤＣＩＰＰ暴露下大鼠血清Ｔ３和Ｔ４水平下降，而低水平的甲状腺激素循环负反馈调节下丘脑产生ＴＲＨ，ＴＲＨ作用于垂体使其释放ＴＳＨ，因此ＴＳＨ低剂量组升高。在ＴＳＨ的持续刺激下，导致甲状腺出现增生等病理性改变；增生的甲状腺滤泡上皮细胞反过来又产生甲状腺激素。因此中、高剂量组的ＴＳＨ的水平相对又有升高的表现，而Ｔ３水平在高剂量组出现显著性升高，这与ＴＤＣＩＰＰ暴露的斑马鱼模型中，血清Ｔ３水平升高，Ｔ４水平下降；鸡胚胎经过一定剂量ＴＤＣＩＰＰ处理后，同样降低血清Ｔ４水平，但不改变Ｔ３水平相似［４］。本研究中各剂量组大鼠的血清Ｔ４和ＦＴ４水平与对照组相比没有统计学意义，这与Ｍｏｓｅｒ等指出ＴＤＣＩＰＰ染毒的孕期Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ大鼠及其所产仔鼠血清Ｔ３和Ｔ４水平均未发现具有统计学意义的改变基本一致［５］。
甲状腺组织中，三个ＴＤＣＩＰＰ暴露组中ＴＰＯｍＲＮＡ和蛋白水平的表达均高于对照组，ＮＩＳ
和ＴＧｍＲＮＡ表达在高剂量暴露组表达显著高于对照组。这可能是由于在ＴＤＣＩＰＰ的持续刺激下，甲状腺激素不能够满足机体需求时，甲状腺组织代偿需要，ＮＩＳ、ＴＧ、ＴＰＯ基因表达增多，以合成更多的甲状腺激素来满足机体的需要。另外与甲状腺激素水平相关的几个基因中，ＣＹＰ３Ａ基因编码单氧化酶类，该类酶能够催化外源化合物以及内源性胆固醇，ＵＧＴ１Ａ基因与肝脏代谢，甲状腺激素的胆汁清除密切相关［６］。这与此前报道ＴＤＣＩＰＰ暴露改变人工培养鸡的胚胎和肝细胞中ＣＹＰ３Ａ３７，ＣＹＰ２Ｃ４５，ＵＧＴ１Ａ１和ＵＧＴ１Ａ９基因的表达基本一致。在ＴＤ ＣＩＰＰ暴露下，机体Ｔ３和Ｔ４水平降低，引起与甲状腺ＴＲβ受体相关通路的转录应答降低有关。这与ＴＤＣＩＰＰ暴露能够引起斑马鱼甲状腺ＴＲα受体相关通路的转录应答有关报道一致［７］，具体机制有待进一步研究。
总之，ＴＤＣＩＰＰ短期暴露可以对大鼠引起的潜在甲状腺毒性效应，上调细胞素酶ＣＹＰ３Ａ１、葡糖苷酸转运酶ＵＧＴ１Ａ６基因和蛋白、脱碘酶ＤＩＯ１基因表达，造成血清甲状腺激素Ｔ４和ＦＴ４下降趋势，甲状腺组织增生作为一种代偿机制，又会上调ＴＧ、ＮＩＳ、ＴＰＯ基因和蛋白的表达以便合成足够的甲状腺素，维持甲状腺激素稳态，保障机体正常生理功能。具体的过程和机制还有待于进一步研究。
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