•论著
银杏叶提取物EGb761对大鼠肝缺血/再灌注损伤的 保护作用 张挺1陈萍2赵玉潮2
1武汉市武昌医院麻醉科430063; 2四川大学华西医院宜宾医院，宜宾市第二人民医院麻醉科644000
通信作者：陈萍，Email:chenpingsc@aliyun
【摘要】目的探讨银杏叶提取物(041^〇|^丨(山3 6\的11,£0丨>76丨）对大鼠肝缺血/再灌注(丨8(：|16111丨11/叫61'£1^〇11，丨/1^)损伤的保 护作用及可能机制。方法雄性SD大鼠24只，按照随机数字表法分为4组(每组6只）：假手术组(Sham组）、缺血/再灌注组 (1/R组）、银丧叶提取物EGh761组（EGb组）和银杏叶提取物EGI，761 +丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, \1，入？10激动剂|579350组（£0丨>+11组）。5(1£^组大鼠仅游离肝门处血管；1出组大鼠采用夹闭肝左叶、中叶脉管共干30>^1制备 70%肝1/1?损伤模型$「，丨)组大鼠建模前301^11静脉注射£〇1576丨50|1咕/1^;£61^^组大鼠建模前5()连续静脉注射20<%^79350 溶液0.1 m l/d，其余操作同EGb761组。再灌注6h时，取血后处死大鼠，ELISA法检测肝功能指标ALT、AST和谷氨酰转肽酶("y-glulamyl transpeptadase, GGT) , TUNEL法观察细胞调亡情况，留取月干组织采用Western hlot法检测p38 MAPK表达水平 结果与Sham组比较，丨/R组、EG1)组和EGb+p组大鼠血清A l,T、AST和GGT浓度明显升高（P<0.05)，细胞凋亡率增加（P< 0.05), P38 M APK表达增加（P<0.05)。与I/R组比较,EGb组大鼠血清A LT、AST和GGT浓度明显降低(P<0.05)，细胞凋亡率降低(P<0.05),p38 MAPK表达降低（P<0.05);EGb+p组各指标与I/K组比较差异无统计学意义（P>0.05)。结论EGb76丨对肝I/R损伤具有保护作用，其机制可能与抑制肝P38MAPK表达有关。 【关键词】银杏叶提取物；肝；缺血/再灌注损伤；丝裂原活化蛋内激酶
DOI： 10.3760/321761-20210118-00272
Ginkgo biloba extract (EGb761) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in rats
Zhang Ting1，Chen Ping2, Zhao Yuchao2
因特网的应用'Department of A nesthesiology, Wuhan Wuchang Hospital, Wuhan 430063, China; department of A nesthesiology, West China Yibin Hospital, Sichuan University, the Second People's Hospital ofYibin, Yibin 644000, China
Corresponding author: Chen Ping, Email:*********************
【A bstract】Objective To investigate the protective effects of Ginkgo biloba extract (EGb761) on hepatic ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats and possible mechanisms. Methods According to the random number table method, 24 male SD rats were divided into four groups (n=6):a Sham group, an I/R group, an EGb761 (EGb) group and an EGb761+mitogen-activated protein kinase (MAPK) agonist p79350 (EGb+p) group. Rats in the Sham group were dissected the porta without ligation alone; those in the I/R group were used to establish a model of 70% hepatic I/R through clamping the left and middle hepatic vein vessels for 30 min; those in the EGb group were intravenously injected with 50 mg/kg EGb761 30 min before modeling; and those in the EGb+p group were intravenously injected with 20% p79350 solution at 0.1 ml/d for five consecutive day before modeling, in addition to the same treatment in the EGb group. After reperfusion for six hours, the rats were sacrificed and blood samples were collected. The levels of hepatic function indexes such as alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and 7-glutamyl transpeptidase (GGT) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The apoptosis of hepatic cells was assessed by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay. The expression of p38 MAPK was detected by Western blot. Results Compared with the Sham group, the I/R group, the EGb group and the EGh+p group showed remarkable increases in the levels of ALT, AST and GGT (P<0.05); in the apoptosis rate (P<0.05) and p38 MAPK
expression (P<0.05). Compared with the I/R group, the EGb group produced remarkable decreases in the levels of ALT, AST and GGT (P<0.05); in the apoptosis rate (P<0.05) and p38 MAPK expression (P<0.05). There was no significant difference as to the above indicators between the EGh+p group and the I/R group (P>0.05). Conclusions EGb761 has protective effects on hepatic I/R injury, which may be related to inhibiting the expression of p38 MAPK in the
【K eyw ords】Ginkgo l)ilol)a extract; Liver; Ischeniia/reperfusion injury; M itogen-activated protein kinase DOI ： 10.3760/rm 321761 -20210118-00272
肝缺血/再灌注（ischeniia/reperfusion，I/R)损伤 是指肝在缺血后重新获得血流，缺血损伤不但没有 减轻反而加重的病理生理现象m。肝是一个血液供 应丰富的器官，严重的创伤、感染、烧伤、休克、阻断 肝门动脉、器官移植等均可导致急性肝缺血和随后 的I/R损伤；肝叶切除或肝移植等过程都可能存在 肝丨m损伤，导致肝功能严重损害，从而影响疾病预 后及手术成功率1\
肝[/R损伤机制包括微循环障碍、氧自由基大 量生成、钙超载和肝Kupffer细胞活化等' 其中氧 自由基大量生成和氧化应激是肝I/R损伤的病理生 理基础。丝裂原活化蛋卩丨激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK>被认为是参与氧化应激所致 氧化损伤的重要信号通路|41，大量证据表明，MAPK 信号通路在心脏、肾和神经丨/R损伤过程中被激活，最终导致器官功能受损151。
从银杏叶中提取的有效成分主要为总黄酮类 及银杏内醋等，简称为银许叶提取物(Ginkgo liiloba extract,EGb761)，是天然的血小板活化因子受体诘 抗剂。EGb761可以直接清除超氧阴离子自由基和 羟基自由基，保持机体超氧化物歧化酶水平，保护 机体不受自由基损害，维持机体的正常代i射|61。在 缺血条件下，EGb761预处理可显著降低细胞水肿 和神经退化，对神经元细胞起到保护作用|71。然而，EGh761对肝I/R损伤是否有保护作用及机制，有待 进一步研究。本研究拟建立大鼠肝1/R损伤模型，探索EGB761对肝I/R损伤的影响及其作用机制。
1材料与方法
1.1材料
雄性SD大鼠24只，体重220~250 g，上海交通 大学医学院实验动物中心提供。本研究操作程序 经四川大学华西医学院动物伦理委员会批准(201801823)。£Gh761注_(生产批号:H20140770, 台湾济生化学制药厂股份有限公司，中国），ELISA 试剂盒（生产批号：EK-H10789，上海通蔚试剂有限 公司，中国），TUNEL试剂盒（生产批号：C1088，上海 碧云天生物技术有限公司，中国），P38 MAPK—抗 和二抗（生产批号：AH01202，赛默飞世尔科技公司，美国）。1.2方法
1.2.1动物分组
南山114
按随机数字表法将大鼠分为4组（每组6只）：假手术组（Sham组）、缺血/再灌注组（I/R组）、银杏 叶提取物EGb761组（EG b组）和银杏叶提取物EG1>761+丝裂原活化蛋白激酶激动剂p79350组 (EGh+p组）。Sham组大鼠仅游离肝门处血管；I/R 组大鼠采用夹闭肝左叶、中叶脉管共干30 min制备 70%肝I/R损伤模型；EGb组大鼠在建模前30 m in 经静脉注射EGh761 50 mg/kg;EGb+p组大鼠于建模 前5 d连续静脉注射20%P79350溶液0.1m l/d，其余 操作同EGb761组。
1.2.2肝I/R模型建立
大鼠术前禁食12h，自由饮水。法 建立70%的肝I/R模型181：腹正中切口，自剑突向下 4~5 cm，分离并显露出肝门，在尾状叶上方进行钝 性分离，游离出肝左叶、中叶、右中叶及方形叶的血 管和胆管。夹闭左叶、中叶脉管共干30 min后，恢 复肝血供。Sham组仅分离血管，不夹闭。
1.2.3六1^、人51'和谷氨酰转肽酶（711_11^1〇^8-
peptaclase，GGT)浓度测定
再灌注6 h时，从各组大鼠肝门静脉取血2 ml, 3 000 g离心10 min后取上清3按照ALT、AST和GGT的ELISA试剂盒说明逐步操作，用酶标仪测定 浓度。
1.2.4细胞凋亡率测定
处死各组大鼠后取部分肝组织，Bouin液同定 后石蜡包埋，5 |xm层厚切片，切片固定于载玻片行 TUNEL染，TUNEL法检测肝细胞原位凋亡情况，凋亡的细胞核被染成黄。计算5个高倍视野下凋 亡细胞占观察细胞的百分比，即为细胞凋亡率。
1.2.5p38MAPK检测
取出的新鲜肝组织剪成细小碎片，按每20 m g 组织加人150〜250 |xl裂解液，肝组织用匀浆器匀浆 至到完全裂解；裂解后的样品4 1、1 200 g离心 15 min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80 t冰 箱保存。用12%SDS-PAGE分离目的蛋白。电泳完 毕后取出凝胶，将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维 膜上。将硝酸纤维膜于特异的一抗和二抗孵育(抗 体用TBST缓冲液稀释，一抗与二抗孵育之后用
Sham 组I/R 组EGh 组FX 丨>+p 组
组别
Sham 组丨/R 组EG 丨趙EGb+p 组
组别
Sham 组丨/R 组EG 跑EGb+p 组
组别
®
—
⑧
—
©
注：与Sham 组比较，f <0.05；与丨/R 组比较，h/^O.OS ; Sham 组：假手术组；丨/R 组：缺血/再灌注组；EGh 组：银杏叶提取物EGb76丨组；FXb+P 沮：银杏叶提取物EGh761+丝裂原活化蛋白激酶激动剂丨)79350组;GGT ：谷氨酰转肽酶
图1
3组大鼠血清ALT 、AST、GGT 浓度比较A ：血清ALT 浓度比较;B ：血清AST 浓度比较;C ：血清GGT 浓度比较
TBST 缓冲液洗膜3次，每次15 min )。蛋白条带用 Odyssey Imaging Systems 显影并保持图像。蛋白条 带的光密度用Image Pm Plus 5.1软件进行定量分 析，以P38 MAPK 蛋白条带灰度值与同一样本内参 Tubulin 条带灰度值之比反映其表达水平。1.3统计学分析
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。用 Shapiro -Wilk 法进行正态性检验，Leven 法进行方差 齐性检验。正态分布的计f l 资料以均数±标准差 (知)表示。组间比较用单因素方差分析，两两比较 采用LSD -<；检验。P <0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1大鼠血清ALT 、AST 、GGT 浓度比较
与Sham 组比较，
丨/K 组、EGb 组和EGI )+p 组大鼠
血清ALT 、AST 、GGT 浓度明显增高(P <0.05)。与I/R 组比较，EGb 组ALT 、AST 、GGT 浓度明显降低（P < 0.05)，而EGb +p 组ALT 、AST 、GGT 浓度差异无统计 学意义(P >0.05)。见图1。2.2大鼠肝细胞凋亡情况比较
与Sham 组比较，丨/R 组、EGb 组和EGl )+p 组肝细 胞凋亡率明显升高（P <0.05)；与丨/R 组比较，EGb 组 肝细胞凋亡率明显下降（P <0.05); EGh +P 组与1/R 组比较肝细胞凋亡率差异没有统计学意义
（P > 0.05)。见图 2。
2.3大鼠肝组织p 38 MAPK 表达比较
与Sham 组比较，丨/R 组、EGb 组和EGI )+p 组大 鼠肝组织p 38 MAPK 表达明显增加（P <0.05)。与 I /R 组比较,EGb 组肝组织p 38 MAPK 表达明显降低 (P <0.05 )；而EGb +p 组与丨/R 组比较差异无统计学 意义(P >0.05)。见图3_
3讨论
本研究发现EGh 761能够明显改善肝I /R 所致
的肝功能损伤，减轻肝细胞凋亡；其机制可能与
EGI >76丨抑制P38 MAPK 表达有关。
氧化应激是肝I /R 损伤的始发因素，并由此导 致肝功能损伤和肝细胞凋亡。一系列抗氧化策略 用来I /R 所致的器官功能损伤，如缺血预处理、 抗氧化剂的使用和抑制线粒体通透性转换' 银杏 是我国的特产植物，其广泛的药理作用史有记载。 目前临床上所用的银杏叶提取物多为其标准制剂 EGb 761，
麦克斯韦理论其主要活性成分有24%黄酮类和6%萜类
内酯两大类，另外还有少量的酚类、生物碱、长链 醇、酮类、氨基酸以及钙、镁、铁微量元素等主要化 学成分|71。其中黄酮类化合物是银杏叶中所含的主 要药理学成分，黄酮苷分子母核中含有还原性羟基 (-OH )功能集团，可直接清除氧自由基[”。Tamatani 等11151发现，EG 1)761能通过抑制caspase -3活性减轻缺 氧诱导的培养皮层神经元凋亡；T u 等m 发现， EGb 761通过清除活性氧自由基，对阿尔茨海默病 有一定的作用；Li 等1121研究发现EGb 761预处理 能够减轻心肌I /R 损伤。本研究发现，肝1/R 损伤 后，肝功能指标ALT、AST 和GGT 明显升高，肝细胞 凋亡率增加，p 38 MAPK 表达增加；EGb 761能够抑 制P38 MAPK 表达，明显改善肝丨/R 损伤；当提前注 射P38 MAPK 激动剂p 79350后，EGb 761这一保护作 用消失；证实EGh 76l 能够明显改善肝I/R 所致的肝 功能损伤，其机制与EGb 761抑制P38 MAPK 表达 有关。
MAPK 是一类广泛存在于体内的丝氨酸/苏氨 酸蛋白激酶，通过三级激酶级联反应使细胞外刺激
通过这些途径的上游成员磷酸化进而激活下游信xcel
Sham组 丨/R组 EGb组 EGb+p组
组别 ®注：与Sham组比较，*^<0.05；与丨/R组比较，h P<0.05；箭头所示为凋亡肝细胞；Sham组：假手术组；丨/R组：缺血/再灌注组；EGb组：银杏叶提取物EGb761组；FXb+p组：银杏叶提取物EGb761+丝裂原活化蛋白激酶激动剂P79350组；
图2 3组大鼠凋亡情况比较(TUNEL染X200) A:Sham组；B:l/R 组;C:EGb组；D:EGb+P组；E:3组大鼠凋亡率比较
P38 MAPK
Tubulin
Sham组 I/R组 EGb组EG丨)+p组
!_________________________________
0.8
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撇0.6
友
^0.4
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^0.2
Sham组EGb+p组
I/R组 EGb组
组别
注：与Sham组比较/P<0.05；与丨/R组比较，h P<0.05;Sham组：假手-术组；丨/R组：缺血/再灌注组；EGb组：银杏叶提取物EGb761组；FXb+p组：银杏叶提取物FXA76丨+丝裂原活化蛋白激酶激动剂P79350组；M APK：丝裂原活化蛋白激酶
图3 3组大鼠P38 M APK表达情况比较
号转导通路介导多种细胞内信号转导"3|。该通路可 由多种因子刺激而激活，活性氧是其中最重要的刺激因素之一。其中P38MAPK信号通路可经丝裂原 活化蛋白激酶3和丝裂原活化蛋白激酶6激活，进 而调节机体免疫反应、细胞凋亡以及细胞周期改变 等|14'151。本研究发现大鼠肝I/R损伤建模之前，静脉 注射EG1>761能够明显减轻肝功能的损伤，减轻肝 细胞凋亡率；当静脉注射MAPK激动剂P79350, EGb761的这一保护作用消失。由此可以推测MAPK信号通路是EGI)761减轻肝丨/R损伤中的关键 分子靶点。
综上所述，本研究表明EGb761对大鼠肝I/R损 伤具有保护作用，其保护作用的机制可能与抑制 P38 MAPK的表达有关。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献
我不是宋承宪歌词
I 1] Zhou J, Chen J, Wei Q, et al. The role of ischemia/reperfusion in
jury in early hepatic allograft clysfunction[J]. Liver Transpl, 2020, 26(8): 1034-1048. D01：10.1002/lt.25779.
[2]刘瀚予.贾莉莉，杜洪印，等.TLR4/Src•信号通路在肝缺血再灌
注大鼠海马NLRP3炎症小体激活中的作用[J】.中华麻醉学杂2020, 40(2): 233-236. DOI：10.3760/cma.j.issn.0254-1416.20
20.02.027.
[3 ] Konishi T, Lentsch AB. Hepatic ischemia/reperfusion: Mecha
nisms of tissue injury, repair, and regeneration^]. Gene Expr, 2017, 17(4)：277-287. DOI：10.3727/105221617X1504275087 4156.
[4] Hirata Y. [Reactive oxygen species (ROS) signaling: Regulatory
mechanisms and pathophysiological roles] [J]. Yakugaku Zasshi.
2019, 139(10): 1235-1241. DOI：10.1248/yakushi.19-00141.
[5] Tikkanen R, Nikolic-Paterson DJ. Mitogen-activated protein ki
nases: Functions in signal transduction and human diseases [J/OL]. Int J Mol Sci, 2019, 20(19): 4844. DOI: 10.3390/ijms2019 4844.
[6] Chen L, Zhang C, Han Y, et al. Gingko biloba extract (EGb) inhib
its oxidative stress in neuro 2A cells overexpressing APPsw [J/OL]. Biomed Res Int, 2019, 2019： 7034983. D01:10.1155/2019 /7034983.
[7] Thancharoen 0, Limwattananon C, Waleekhachonloet 0, et al.
Ginkgo biloba Extract (EGI>761), cholinesterase inhibitors, and memantine for the treatment of mild-to-moderate Alzheimer^s dis
ease: A network meta-analysis[J]. Drugs Aging, 2019, 36(5): 435-452. DOI： 10.1007M0266-019-00648-x.
[8] Kobayashi H, Nonami T, Kurokawa T, et al. Mechanism and pre
vention of ischemia-reperfusion-induced liver injury in rats[J |. J Surg Res. 1991, 51(3): 240-244. DOI: 10.1016/0022-4804(91)901
01-q.
[9] Granger DN, Kvietys PR. Reperfusion injury and reactive oxygen
species: The evolution of a concept[J/OL]. Redox Biol. 2015, 6: 524-551. DOI： 10.d〇
x.2015.08.020.
[10] Tamatani M, Ogawa S, Tohvama M. Roles of Bcl-2 and caspases
in hypoxia-induced neuronal cell death: A possible neuroprotec-
tive mechanism of peptide growth factors[J]. Brain Res M ol
Brain Res, 1998, 58(1-2): 27-39. DOI: 10.1016/s0169-328x(98)
00095-3.
[11] Tu JL, Chen WP, Cheng ZJ, et al. EGb761 ameliorates cell
necroptosis by attenuating RIP 1-mediated mitochondrial dys
function and ROS production in both in vivo and in vitro models
of Alzheimer's disease[J]. Brain Res, 2020, 1736: 146730. DOI:
10.1016/j.brainres.2020.146730.
[12] Li T, Zhang Y, Tian J, et al. Ginkgo biloba pretreatment attenu
ates myocardial ischemia-reperfusion injury via mitoBK(Ca) [J].
Am J Chin Med, 2019, 47(5): 1057-1073. DOI： 10.1142/SO1924
15X1950054X.
[13] Johnson GL, Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase path
ways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases[J]. Sci
ence, 2002, 298(5600): 1911-1912. DOI: 10.1126/science. 107
2682.
[14] Liu J, Chang F, Li F, et al. Palmitate promotes autophagy and
apoptosis through ROS-dependent JNK and p38 MAPK[J]. Bio-
chem Biophys Res Commun, 2015, 463(3): 262-267. DOI:
白喉杆菌10.1016/j.bbrc.2015.05.042.
[15]卜月，陶涛，席宏杰.右美托咪定预处理对大鼠肝缺血/再灌
注损伤的作用[J].国际麻醉学与复苏杂志，2018, 39(5):
405-409, 421. DOI：10.3760/c-ma.j.issn. 1673-4378.2018.05.005.
(本文编辑：孙婷）
本刊可直接使用缩略语的术语
ADP 腺苷二鱗酸（adenosine (丨iphosphate；又称：二鱗酸
腺苷）
ALT 丙氧酸转氣酶(alanine aminotransferase；又称：谷
丙转氨酶，丙氨酸氨基转移酶）
ASA 美国麻醉医师协会（American Society of Anesthesiologists) AST 天冬氧酸转氧酶(aspartate aminotransferase；又称：谷草转氨酶，天门冬氨酸氨基转移酶）
ATP 腺苷三鱗酸(adenosine triphosphate；又称：二••憐酸腺背）BCA 二喹琳甲酸（丨)icinchoninic acid)
BIS 脑电双频指数(bispectral index)
BMI 体重指数（丨)ody mass index)
BUN 尿素氣（blood urea nitrogen)
(3-actin P_肌动蛋白
Cl 置信区间（confidence interval)
CPB 体外循环（cardiopulmonary bypass)
Cr 肌酐（creatinine)
CT 计算机断层扫描术(computer tomography)
CVP 中心静脉报(central venous pressure)
DAB 二氧基联笨胺（3，3’-diaminobenzidine)
DBP 舒张压（diastolic b丨ood pressure)
ECG 心电阁(electrocardiogram )
ECL 电化学发光（electrochemiluminescence)
ED50 半数有效M( median effective dose)
ELISA 酶联免疫吸附测定（enzyme-linke dimmunosorbent assay) Fi02吸入氧比例（fraction of inspiratory oxygen，又称：吸人氧浓度）
Hh 血红蛋白（hemoglobin)
Hct 血细胞比容（hematocrit)
H-E染苏木精-伊红染(hematoxylin-eosin)
ICU 重症监护病房（intensive care u n it；又称：重症监护室）
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IL 白细胞介素(interleukin)
MAC 最低肺泡有效浓度（minimum alveolar concentra
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MAP 平均动脉压（mean arterial pressure)
MRI [核]磁共振成像（magnetic resonance imaging)
NF-k B核因子-k B( nuflear fact<)r-KB)
NMDA N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate)
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Pa02动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen)
PaCO, 动脉血二氧化碳分压（arterial partial pressure of carbon
dioxide)
PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline)
PCR 聚合酶链[式]反应（polymerase chain reaction)
PF T C02呼气末二氧化碳分压（end-tidal carbon dioxide partial
pressure)
PMSF 苯甲基横酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride)
PVDF 聚偏二氟乙稀（polyvinylidenefluoride)
RBC 红细胞(red blood cell)
RIPA 放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay)
RT-PCR 逆转录聚合酶链[式]反应（reverse transcription PCR)
SBP 收缩压（systolic 丨)1〇〇(丨 pressure)
S D S-P A G E十二烧基硫酸钠-聚丙稀醜胺凝胶电泳（sodium dodecyl- sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)
Sp02脉搏血氧饱和度（pulse oxygen saturation)
TNF-a 肿瘤坏死因子-a( tumor necrosis factor-a)
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(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediateddUTP-
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