作者：上海市东方医院检验科陈存存综述, 范列英审校
一、抗HCV抗体筛查试验试剂及复检程序
目前经美国FDA注册或批准的可以在美国应用的抗HCV抗体筛查试剂包括3种免疫产品:美国雅培公司Abbott HCV EIA 2.0(2014年升级到Enzygnost Anti-HCV version 4.0)和美国强生公司的2种产品 Ortho HCV version 3.0 ELISA和CLIA试剂VITROS Anti-HCV assay。所有这些免疫分析试剂均应用HCV编码的重组抗原。已有数十种国产或进口的检测抗HCV抗体的ELISA或CLIA试剂获准在国内使用(如Abbott GmnH & CO.KG、Ortho-Clinical Diagnostics 的CLIA VITROS Anti-HCV CIA和北京科美的CLIA抗HCV试剂盒等)。对于ELISA(如HCV EIA 2.0和HCV version 3.0 ELISA)抗HCV抗体呈阳性反应的样本应进行双孔重复检测。双孔复检中只要有一孔的检测结果呈阳性反应, 则样本可判定为抗HCV抗体初筛试验呈阳性反应。对于CLIA(如VITROS Anti-HCV assay), 单次有反应性的结果即可被判定为初筛试验阳性。 二、抗HCV抗体筛查试验的假阳性现象
HCV EIA 2.0(及升级后的4.0)和HCV version 3.0 ELISA用于检测HCV一般感染率人的特异性≥ 99%, 然而在HCV感染的低流行(流行率< 10%)人中,="">< 10%的地区,="" 在免疫功能正常人,="" 包括无偿献血员、现役或退役军人、普通人、卫生保健从业人员、性传播疾病门诊就诊的人员等,="" 用hcv="" eia="" 2.0和hcv="" version="" 3.0="" elisa试剂进行检测的假阳性结果平均比例为35%(范围为15%~60%)[4,="" 5,="" 6,="" 7,="" 8,="" 9,="" 10,="" 11]="" 。在免疫功能低下的人(如血液透析患者)中,="" 假阳性结果的平均比例为15%[12]。在非洲加蓬对762例hiv阳性的患者进行抗hcv抗体筛查,="" 应用第4代elisa试剂初筛信号/临界值(signal-to-cut="" off,="" s/co)比值≥="" 1.0的67例呈阳性反应的样本,="" 进一步用hcv="" rna="" 逆转录聚合酶链反应(polymerase="" chain="" reaction,="" pcr)验证,="" 其中20例(29.9%)为假阳性;="" 57例初筛s/co比值≥="" 1.7="" 的样本经inno-liatm="" hcv="" ab="" ⅲ="" 免疫印迹法(western="" blotting,="" wb)试剂确认,="" 假阳性14例(24.6%)="" [13]="" 。在乌干达对1="" 000例无hcv感染史样本(其中500例hiv阳性)进行抗hcv抗体初筛,="" 其中76例抗hcv抗体呈阳性反应(s/co比值≥="" 1.0),="" 进一步采用金标准hcv="" rna核酸检测(nucleotide="" acid="" test,="" nat)确认只有2例可检测到hcv="" rna,="" 表明76例中有74例为抗hcv抗体假阳性[14]。任芙蓉等[15]用ortho="" hcv="" 3.0="" eia和6
种国产抗hcv抗体elisa初筛试剂检测均呈阳性反应的采自北京等5座城市献血员的84份样本,="" 确证试验nat或重组免疫印迹试验(recombinant="" immunoblot="" analysis,="" riba)阳性76份,="" 假阳性率为9.5%;="" 上述7种试剂检测结果不一致的63份样本nat确证试验均为阴性,="" riba确证试验仅有1份为阳性。万大朋等[16]曾报道,="" clia抗hcv抗体初筛呈阳性反应的100份样本用riba确认为阳性的仅56份,="" 不确定和阴性分别为33份和11份。因此,="" 不能单独依靠初筛试验阳性结果来判断受检者是否感染hcv,="">
三、抗HCV抗体产生假阳性的原因
1.抗原
检测抗HCV抗体的间接ELISA和CLIA试剂所用的抗原为基因工程法制备的融合蛋白, 所包含的来自表达载体大肠埃希菌等的一些序列可与血清中抗大肠埃希菌的因子发生反应而产生假阳性结果; 在合成肽制备过程中, 如果某些肽序列错误, 会导致合成肽特异性改变而产生假阳性; 利用大肠埃希菌大规模表达后经破碎细胞、盐析、离子交换柱等分离纯化步骤得到的HCV重组抗原, 如果纯度达不到100%, 受过大肠埃希菌感染的血清可与抗原中杂蛋白产生反应而引起假阳性。
2.血清IgG浓度
人血清中IgG的浓度对间接ELISA抗HCV抗体检测效果有较大的影响, 酶标的第二抗体能与人所有IgG结合, 而IgG吸附于板孔的能力很强, 虽然10 μ L反应血清采用100 μ L缓冲液稀释以降低本底, 但在某些血清IgG水平偏高的受检者仍有可能出现弱假阳性。
3.结缔组织病
结缔组织病如系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等病症时, 血清中的风湿小体和其他异常IgG(IgG浓度达到50 mg/mL)会引起本底升高或假阳性。
4.溶血
溶血时释放到血清中的血红蛋白具有过氧化物酶的性质, 当其通过吸附或“ PP效应” (蛋白质间相互吸附的现象)相互结合后, 可催化A、B液显而造成假阳性。
四、 抗HCV抗体确证试验试剂及结果报告
美国CDC建议:需经更特异的血清学试验如抗 HCV抗体RIBA或HCV RNA NAT对抗HCV抗
体筛查结果进行补充确认[17], 才能作为受试者感染HCV的血清学依据。
1.抗HCV抗体确证试验试剂
支撑架目前唯一经美国FDA注册的抗HCV抗体WB补充确证试剂是Chiron公司的Chiron RIBA HCV 3.0 SIA。RIBA HCV 3.0 SIA应用HCV编码的重组蛋白和合成多肽进行血清学分析, 可对抗HCV抗体筛查检测呈阳性结果的血清或血浆样本进行确认。其他WB确证试剂有BIO RAD公司的DECISCAN HCV PLUS、Organon公司的Liatek-Ⅲ 、 Genelabs公司的WB、Immuno Diagnostic Oy 公司的Inno-LiaTM HCV Ab Ⅲ 、Abbott公司的MATRIX HCV 2.0和 Murex Western blot等[18, 19, 20]。而获得美国FDA批准的逆转录PCR定量检测HCV RNA的试剂有Roche 公司的AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test(version 2.0)和COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test(version 2.0), 检测下限约为50 IU/mL[21], 还有Chiron 公司基于转录介导扩增技术的 Procleix HIV-1/HCV assay 检测系统。目前已有数家国内公司生产的NAT定量检测HCV RNA试剂获中国FDA批准(如深圳匹基、上海科华、深圳达安以及华美等公司)。NAT在实现“ 零风险” 输血目标中发挥重要作用, 可在病毒抗原或抗体产生之前检测到, 以鉴别在窗口期的输血病毒感染[22, 23]。
巴尔特
2.抗HCV抗体确证试验结果报告
抗HCV抗体初筛试验呈阳性反应, RIBA和/或HCV RNA检测阳性, 可确认抗HCV抗体阳性; 而抗HCV抗体初筛试验呈阳性反应, HCV RNA检测阴性, RIBA阳性, 则确认抗HCV抗体阳性, 提示既往或现症HCV感染, 单个HCV RNA阴性结果不能排除活动性感染; 若抗HCV抗体初筛试验呈阳性反应, HCV RNA检测阳性, RIBA阴性, 提示受检查可能处于HCV感染的窗口期, 应在其后半年内定期复查; 若抗HCV抗体初筛试验呈阳性反应, RIBA或HCV RNA检测均为阴性, 则为抗HCV抗体筛查试验假阳性。
五、抗HCV抗体检测假阳性结果对策
1.制定提高抗HCV抗体筛查试验阳性预测值方案的必要性和可能性
易服癖
由于RIBA或NAT确证试验价格昂贵或对试验设施和技术要求较高且不能快速出结果, 需要有既能提高检测结果的阳性预测, 又可以减少进行确证试验的样本数的替代方案。DUFOUR等[24]利用第1代HCV ELISA试剂对美国无偿献血者进行回顾性分析发现, 其S/CO比值与RIBA 2.0确证试验结果存在明显相关性, S/CO比值≥ 2.5时, 约有75%的样本经泵效率
确认为阳性。美国CDC进行了一项调查, 用ELISA和CLIA在不同感染率的无症状人中进行抗HCV抗体初筛, 所有ELISA初筛呈阳性反应的样本均用RIBA 3.0进行确证试验, 且均用以下3种NAT试剂中的至少2种进行确证试验:Chiron 公司基于转录介导扩增技术的 Procleix HIV-1/HCV assay 检测系统、AMPLICOR和套式逆转录PCR。初筛结果与补充确证试验的相关性分析显示, 当用ELISA筛查S/CO平均值≥ 3.8或CLIA筛查S/CO平均值≥ 8.0时, 阳性预测值均可≥ 95%, 在不同的流行率体间前者阳性预测值变化范围在95%~97%, 后者阳性预测值变化范围在95%~98%; S/CO比值低的样本中假阳性率较高, 而HCV低感染率人中, S/CO比值低的样本相对较多。因此, 初筛试验结果呈阳性反应的样本中抗体假阳性(RIBA阴性)或RIBA不确定的比例与人的HCV流行率呈负相关[17]。
2.国内机构制定提高抗HCV抗体筛查试验阳性预测值方案的尝试
CONTRERAS等[25]制定的西班牙对抗HCV抗体初筛结果的解释指南也建议, S/CO比值可以作为将抗HCV抗体筛查试验呈阳性反应的结果分为极低、低和高3组抗HCV水平的最有效的依据。极低抗HCV抗体水平组无须进一步的确证试验即可报告阴性, 低抗HCV抗体水平组由于假阳性率较高推荐用WB确认, 只有WB阳性的对象才有必要做HCV RNA检测。国
内任芙蓉等[15]对来自北京等5座城市以Ortho和6种国产ELISA试剂初筛均呈阳性反应的84名献血员的样本用Chiron 公司的 Procleix HIV-1/HCV assay 检测系统进行HCV RNA NAT, NAT阴性的再用Chiron的 RIBA HCV 3.0检测, 以NAT或RIBA 阳性为真阳性, 结果提示, 当筛查结果阳性预测值≥ 95%时, Ortho HCV 3.0 EIA、吉比爱、金伟凯、华美、科华、新创和万泰等7种ELISA试剂的S/CO比值范围分别为≥ 3.8、7.0、10.0、6.0、10.0、8.6和14.0。万大朋等[16]报道, 在以VITROS Anti-HCV assay(CLIA)为初筛试剂检测呈阳性反应的来自就医患者的100份样本中, 1.0<>< 8.0的50份样本riba确证试验阳性仅12份(阳性预测值为24%),="" 而s/co比值≥="" 8.0的50份样本确证试验riba阳性44份(阳性预测值为88%)。不论以elisa亦或clia作为初筛试剂,="" 在不同hcv感染率的人中,="" 可使阳性预测值≥="" 95%的初筛结果的s/co平均界值存在差异,="" 因而有必要通过试验确定每个实验室对不同hcv感染率人使用不同的初筛抗hcv抗体试剂时阳性预测值≥="" 95%的s/co比值。在此基础上,="" 应用初筛试验阳性的s/co比值来决定是否需要进行补充确证试验,="">
毒牙六、抗HCV抗体试验诊断的程序及结果报告和解释
综合国内外相关指南, 建议抗HCV抗体实验室检测及报告遵循下列程序:(1) 实验室在应用E
LISA或CLIA初筛试剂之前, 均应通过试验确定在特定人中该初筛试剂呈阳性反应结果的阳性预测值≥ 95%的S/CO比值, 以此作为S/CO高比值与低比值的区分界限。(2) ELISA或CLIA初筛试验结果阴性的样本可直接报告为抗HCV抗体阴性。(3) 对于ELISA或CLIA初筛试验呈阳性反应的样本均应进行双孔(测试)重复检测, 双孔(测试)复检中只要有一个检测结果呈阳性反应, 则样本可判定为抗HCV抗体初筛试验呈阳性反应; 但在未经按下列(4)中所列标准作出判断是否应进行确证试验之前不应报告抗HCV抗体结果。(4) 基于初筛试验的S/CO比值对初筛试验呈阳性反应的样本应作不同处理, 初筛试验S/CO高比值的样本, 可报告抗HCV抗体结果为阳性(但须同时注明只能预测95%的确认阳性, 仍存在< 5%的假阳性)而不必进行确证试验(除非送检者有要求);="" 初筛试验呈阳性反应的s/co低比值的样本,="" 应进行更特异的补充试验予以确认。(5)可以只采用riba确证,="" 按riba确证试验结果报告抗hcv抗体阳性、不确定或阴性,="" 对其中抗hcv抗体不确定的受检者,="" 需要收集另一份样本(=""> 1个月)进行抗HCV抗体或HCV RNA确证试验; 也可以先用NAT 确认, NAT阳性可直接报告HCV RNA阳性(提示活动性HCV感染), 若NAT结果为阴性, 再用RIBA 确认(此方案成本相对低廉), 若NAT和RIBA 确证试验结果均为阴性, 则报告HCV RNA和抗HCV抗体均阴性(即可证实初筛试验结果为假阳性); NAT确证试验阴性而RIBA 确证试验结果为阳性, 则报告
霍氏鲜清抗HCV抗体阳性, HCV RNA阴性(抗HCV抗体的存在提示既往或现症HCV感染, 单次HCV RNA阴性不能排除活动性感染)。
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