银杏叶提取物对TGF -β1诱导增殖的SD 乳鼠心肌成纤维细胞生长抑制作用及其机制 胡方芳1，易鲛隆2，王顺1，成荣1，李伟2，罗振华1
1贵州省人民医院，贵州贵阳550001；2贵州医科大学附属医院
摘要：目的
观察银杏叶提取物（GBE ）对TGF -β1诱导增殖的SD 乳鼠心肌成纤维细胞（CFb ）生长抑制作用，并
探讨其机制。方法
取出生1～3d 的SD 乳鼠CFb 分为4组，其中TGF -β1组加入20ng /mL 的TGF -β1溶液，低浓度
GBE 组加入20ng /mL 的TGF -β1溶液和2μg /mL 的GBE 溶液，高浓度GBE 组加入20ng /mL 的TGF -β1溶液和20μg /mL 的GBE 溶液，对照组加入等量含10%胎牛血清的DMEM 。取各组细胞，继续培养48h ，采用MTT 比法测
算各组细胞增殖率，采用荧光定量PCR 法检测各组细胞结缔组织生长因子（CTGF ）、氨基末端激酶（JNK ）、P 38mRNA 。结果
TGF -β1组、低浓度GBE 组、高浓度GBE 组、对照组细胞增殖率分别为124.1%±13.4%、106.1%±
7.5%、83.5%±5.2%、100.0%，其中TGF -β1组与对照组、高浓度GBE 组相比，P 均<0.05。TGF -β1组细胞CTGF 、JNK 、P 38mRNA 相对表达量均高于对照组（P 均<0.05），高浓度GBE 组细胞CTGF 、JNK 、P 38mRNA 相对表达量均低于对照组和TGF -β1组（P 均<0.05）。结论
高浓度GBE （20ng /mL ）对TGF -β1诱导增殖的SD 乳鼠CFb 有生长抑制
作用，其机制可能与下调TGF -β1-samd /TAK1信号通路中CTGF 、JNK 、P 38基因表达有关。 关键词：银杏叶提取物；心肌纤维化；转化生长因子-β1；TGF -β1-samd /TAK1信号通路；结缔组织生长因子；氨基末端激酶；P 38基因 doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.09.010中图分类号：R542.2+3
文献标志码：A
文章编号：1002-266X （2021）09-0039-04
Inhibitory effect of Ginkgo biloba extract on TGF -β1-induced abnormal proliferation of cardiac fibro⁃blasts and its mechanism
HU Fangfang 1，YI Jiaolong ，WANG Shun ，CHENG Rong ，LI Wei ，LUO Zhenghua 1Guizhou Provincial People ’s Hospital ，Guiyang 550001，China
Abstract ：Objective
To observe the inhibitory effect of Ginkgo biloba extract （GBE ）on transforming growth factor -
β1（TGF -β1）-induced proliferation of SD neonatal rat cardiac fibroblasts （CFb ）and to explore its mechanism.Methods CFb from 1-to 3-day -old SD rats were divided into four groups.CFb in the TGF -β1group were added with 20ng /mL TGF -
β1solution ，the low -dose GBE group with 20ng /mL TGF -β1solution and 2μg /mL GBE solution ，the high -dose GBE group with 20ng /mL TGF -β1solution and 20μg /mL GBE solution ，and the control group with equal amount of DMEM containing 10%FBS.Cells were taken from each group and cultured for another 48h.MTT colorimetry was used to detect
the proliferation rate in each group ，the expression levels of connective tissue growth factor （CTCF ），amino -terminal ki⁃nase （JNK ）and P 38mRNA were detected by RT -PCR.Results
The cell proliferation rates in the TGF -β1group ，low -
dose GBE group ，high -dose GBE group ，and control group were 124.1%±13.4%，106.1%±7.5%，83.5%±5.2%，and 100.0%，respectively ，with statistically significant difference between the TGF -β1group and the high -dose GBE group ，control group （all P<0.05）.The relative mRNA expression levels of CTGF ，JNK and P38in the TGF -β1group were high⁃er than those in the control group （all P <0.05），and the relative mRNA expression levels of CTGF ，JNK ，and P38in the high -dose GBE group were lower than those in the control group and TGF -β1group （all P <0.05）.Conclusion High
concentration of GBE inhibited the growth of TGF -β1-induced proliferation of CFb in SD rats ，and the mechanism may be re⁃
lated to the down -regulation of CTGF ，JNK and P38gene expression in the TGF -β1-samd /TAK1signaling pathway.
Key words ：Ginkgo biloba extract ；myocardial fibrosis ；transforming growth factor -β1；TGF -β1-samd /TAK1sig⁃
·基础研究·
基金项目：贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题（QZYY2017-026，QZYY2016-023）；贵州省普通高等学校科技拔尖人才支
持计划（黔科合KY 字［2016］070）；贵州省科技计划项目（黔科合支撑［2019］2800号）。通信作者：罗振华（E -mail ：luo8300@sina ）；李伟（E -mail ：liwei249188@sina ）
开放科学（资源服务）
标识码（OSID ）
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wap上网naling pathway；connective tissue growth factor；amino-terminal kinase；P38gene
心肌纤维化（MF）是各种因素如高血压、冠心病、心肌病等所致心肌细胞缺血、缺氧及坏死，心肌成纤维细胞（CFb）异常增殖，胞外基质沉积的重塑过程，MF可导致心肌的硬度增加、顺应性降低、舒缩功能下降，是慢性心力衰竭、心源性猝死的影响因素之一［1］。同时，MF还会使心电信号传导受阻，诱发心律失常。因此，研究具有改善MF病变功能的药物对于改善心脏功能及预防慢性心力衰竭的发生具有重要意义。TGF-β1-samd/TAK1信号通路是MF 的关键信号通路［2-4］，其可通过MMP/TIMP调节胶原蛋白的降解。另一方面，TGF-β1-samd/TAK1信号通路还可以通过结缔组织生长
因子（CTGF）和相关
利率敏感性缺口
microRNA调节胶原蛋白的合成。银杏叶提取物（GBE）是以银杏叶为原料，通过加工提取得到的有效成分。研究［5］发现，GBE有清除自由基、抗氧化、改善血液流变学、抗血小板聚集和防治动脉粥样硬化等作用。同时研究［6］发现，经GBE后Ⅰ型糖尿病模型大鼠的心室心肌内血糖、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原、TGF-β1的表达水平均明显降低，推测GBE可通过下调TGF-β1基因表达，减少Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原的合成，进而抑制Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠MF，改善心脏功能。2018年1月—2019年6月，我们观察了GBE对TGF-β1诱导增殖的SD乳鼠CFb的生长抑制作用，并探讨其机制。
1材料与方法
1.1动物、GBE、试剂及仪器清洁级雄性SD大鼠，210～260g，由贵州医科大学实验动物中心提供，饲养于贵州医科大学清洁级实验动物房。培养环境温度、湿度均恒定。SD雌鼠与雄鼠按照3︰1的比例共圈饲养，取出生1～3d的SD乳鼠作为实验用鼠。GBE由中国药品生物制品鉴定所提供，其成分及含量符合国家药品纯度标准。Anti-Vimentin anti⁃body购自美国Proteintech公司，Anti-Actin antibody、ALK5抑制剂SB-431542购自美国ImmunoWay公司，TGF-β1购自美国Pepro tech公司，通用型二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司。CX23光学显微镜、IX71倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司，CFX Connect QPCR仪、凝胶成像仪购自美国BioRAD公司，核酸分析仪购自Thermo公司。
1.2CFb细胞提取、分组及GBE给予取出生1～3d的SD乳鼠心脏［7］进行原代细胞的培养及传代培养，取2～3代生长密度达到80%融合的CFb分为4组，其中TGF-β1组加入20ng/mL的TGF-β1溶液，低浓度GBE组加入20ng/mL的TGF-β1溶液和2μg/mL的GBE溶液，高浓度GBE组加入20ng/mL的TGF-β1溶液和20μg/mL的GBE溶液，对照组加入等量含10%胎牛血清的DMEM。
1.3各组细胞增殖率测算采用MTT比法。取各组细胞，继续培养48h，加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h，吸净上清液，每孔加DMSO150μL，振荡10min，使用酶标仪测定各孔波长为490nm处的光密度值（OD值），计算各组细胞增殖率。各组细胞增殖率=各组OD值/对照组OD 值×100%。实验重复3次，取平均值。
1.4各组细胞结缔组织生长因子（CTGF）、氨基末端激酶（JNK）、P38mRNA检测采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法。取各组细胞，继续培养48h后，TRIzol法提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板、以β-Actin为内参进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃变性30s，60℃退火5s，40个循环。引物序列如下：JNK上游引物为5′-AA⁃CAGCTCGGAACACCTTGT-3′，下游引物为5′-GAT⁃GTACGGGTGCTGGAGAG-3′；CTGF上游引物为5′-AATGCTGT TGAGGAGTGGGTG-3′，下游引物为5′-ACAGGTCTTAGAACAGCCGC-3′；P38上游引物为5′-ACCTAAAGCCCAGCAACCTC-3′，下游引物为5′-AGCCCACGGACCAAATATCC-3′。以2-ΔCt表示细胞中目的基因mRNA的相对表达量。
1.5统计学方法采用SPSS2
2.0统计软件。计量资料以-x±s表示，各实验组间结果均数比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组细胞增殖率比较TGF-β1组、低浓度GBE组、高浓度GBE组、对照组细胞增殖率分别为124.1%±1
3.4%、106.1%±7.5%、83.5%±5.2%、100.0%，其中TGF-β1组与对照组、高浓度GBE组相比，P均<0.05。
2.2各组细胞CTGF、JNK、P38mRNA相对表达量比较各组细胞CTGF、JNK、P38mRNA相对表达量比较见表1。
3讨论
急性心肌梗死（AMI）严重威胁人类健康，介入和药物溶栓的应用极大降低了急性心肌梗死患者的死亡率，但其后期形成的心肌重塑可导致充血性心力衰竭、致死性心律失常等恶性转归，是造成恶性心律失常和猝死的主要病理原因，因此延缓或逆
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转心肌纤维化是防治心肌梗死后心肌重塑的关键。GBE为传统中药银杏叶的主要效应活性物质，含有200多种药用成分，主要活性成分是银杏黄酮和银杏内酯类化合物［8-9］。GBE在降血脂、张扩血管、抗炎、抗过敏、清除自由基、保护心脑血管、降低血清胆固醇等方面发挥药效［10］，在改善心力衰竭、减轻脑梗死面积、营养糖尿病周围神经病变、降低肺动脉高压及肺纤维化等多种疾病中起到广泛作用。研究［11-13］发现，GBE能够对AMI继发心肌重塑具有显著的保护作用，并能够改善CFb病变对继发心肌重构细胞外基质病变相关蛋白以及胶原蛋白表达水平产生影响，同时GBE的活性与其对TGF-β1-samd/TAK1信号通路的调控有关。TGF-β1导致心脏纤维化的相关实验研究主要局限在TGF-β1-samd/TAK1细胞上游信号通路，但对下游信号通路具体调控MF的分子作用机制仍然研究得较少，与剂量是否有关目前也尚未报道。
在组织纤维化过程中，TGF-β1-samd/TAK1细胞信号通路是已知最重要的通路之一。samd作为信号通路的上游信号蛋白因子，在被TGF-β1激活后，活化CTGF、P38-MAPK、JNK-MAPK下游信号通路，从而引起乳鼠炎症因子增加、心脏肥厚、间质纤维化、严重的心功能不全、心肌凋亡甚至死亡。CT⁃GF是近年来发现的一种新的致纤维化的因子，为TGF-β1的下游效应因子，CTGF可接受多种细胞因子刺激［14-16］，如RAS系统、氧化应激、炎性因子等，其中TGF-β1是MF的重要刺激因子，TGF-β1能够刺激CTGF表达上调，同时CTGF与TGF-β1结合后，能刺激samd磷酸化，启动MF过程，
因此二者相互促进，共同参与促纤维化效应，CTGF与TGF-β1一同作用导致哺乳动物多数脏器如肾、肺、心脏等发生纤维化［17］。JNK是TGF-β1-samd/TAK1通路下游信号因子，当JNK被激活后，磷酸化Samd2/3信号转导至细胞核内，形成Samd2/3、Samd4、CBP、TF复合物，介导Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白表达。同时，JNK还可通过Rac1/MLK3/JNK/AP-1通路介导Ⅰ型胶原蛋白表达。在AMI体外模型中，加入JNK抑制剂可显著减少心肌细胞的凋亡［18］。研究［19］表明，JNK被激活可引起小鼠炎症因子增加、心肌细胞肥大、基质增生、心肌细胞死亡。CTGF和JNK间存在复杂的通路联系，UTSUGI等［20］在肺纤维化病理机制研究中发现，
TGF-β1-samd/TAK1信号通路在激活CTGF时，JNK 在介导CTGF表达升高起到重要作用。P38-MAPK 作为samd下游的信号分子，是MAPK信号通路的主要成员，参与了心肌组织纤维化的发生发展，在诱发纤维化过程发展中起着至关重要的作用。有研究表明，在TGF-β1的信号传递过程中，对P38基因的表达干预将会下调TGF-β1的活性，对组织纤维化的过程起到延缓作用。以上研究表明，抑制TGF-β1-samd/TAK1及下游信号因子通路可能成为降低AMI 后大鼠MF的新靶点。本研究结果显示，TGF-β1组CTGF、JNK及P38mRNA表达显著增加，经GBE后三者均降低，且高剂量组减低明显，认为可能与GBE的剂量有关，提示GBE可能通过抑制TGF-β1-samd/TAK1下游信号通路活化，进而抑制CFb增殖，达到延缓心肌纤维化的作用。
综上所述，对于TGF-β1诱导增殖的CFb，GBE 对其增殖具有明显的生长抑制作用，且可能的机制是
通过下调TGF-β1-samd/TAK1信号通路中CTGF、JNK、P38基因的表达。因此，提示GBE对心肌纤维化的发展起到延缓作用。
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表1各组细胞CTGF、JNK、P38mRNA相对表达量比较（-x±s）
组别TGF-β1组低浓度GBE组高浓度GBE组对照组CTGF mRNA
1.42±0.08▲
0.76±0.03
0.64±0.06▲△
1.00±0.02
JNK mRNA
1.28±0.07▲
0.51±0.09
0.37±0.14▲△
1.00±0.10
P38mRNA
1.40±0.04▲
0.61±0.23▲△
0.63±0.24▲△
1.00±0.00
注：与对照组相比，▲P<0.05；与TGF-β1组相比，△P<0.01。
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（收稿日期：2020-07-10）
医药学名词常见错误及正确写法
药品名称：错误（正确）
二磷酸腺苷（腺苷二磷酸），消炎痛（吲哚美辛），阿斯匹林（阿司匹林），维甲酸（维A酸），双磷酸盐（双膦酸盐），甲氨喋呤（甲氨蝶呤），博莱霉素（博来霉素），开浦兰（左乙拉西坦），雷公多苷（雷公藤多苷），非那根（异丙嗪），四乙铵（四乙胺），洗必泰（氯已定），美息律（美西律），大环内脂类（大环内酯类），川穹（川芎），酒精（乙醇），头胞哌酮（头孢哌酮）。
疾病及其相关名称：错误（正确）
甲状腺机能（甲状腺功能），血沉（红细胞沉降率），X光片（X线片），帕金森症（帕金森病），食道（食管），适应征、适应症（适应证），禁忌征、禁忌症（禁忌证），酒精肝（酒精性肝病），心肌梗塞（心肌梗死），脑梗塞（脑梗死），毒副反应（不良反应），肌肉注射（肌内注射），心率失常（心律失常），中风（卒中），生理机能（生理功能），返流（反流），血液动力学（血流动力学），机能（功能），人流（人工流产），药动学（药代动力学），绿脓杆菌（铜绿假单胞菌），机理（机制），围产期（围生期），氧和指数（氧合指数），慢性阻塞性肺病（慢性阻塞性肺疾病），血管紧张素转换酶（血管紧张素转化酶），血管紧张肽转换酶抑制剂（血管紧张素转化酶抑制剂），咳血（咯血），心房纤颤（心房颤动），脑溢血（脑出血），稳定性心绞痛（稳定型心绞痛），法乐四联症（法洛四联症），非何杰金淋巴瘤（非霍奇金淋巴瘤），视网膜神经胶质瘤（视网膜母细胞瘤），剖腹产术（剖宫产术）。
一名退休人员返聘后因工死亡待遇的争议其他：错误（正确）
粘附（黏附），粘痰（黏痰），粘液（黏液），粘滞（黏滞），粘膜（黏膜），粘多糖（黏多糖），多粘菌素（多黏菌素），粘质沙雷菌（黏质沙雷菌），层黏联蛋白（层粘连蛋白），机率、几率（概率），脱腊（脱蜡），侧枝循环（侧支循环），纵膈（纵隔），红血球（红细胞），白血球（白细胞）。
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