基础医学与临床
Basic & Clinical Medicine
May 2021
Vol.41 No.5
2021年5月 第41卷第5期
文章编号：1001-6325(2021)05-0653-08 研究论文
RNA 靶向的CRISPR/CasRx 系统在小鼠精原细胞系GCl-spg 中的应用
李梦真，柳 俊，邹定峰，缪时英，王琳芳，宋伟，李凯*一江春水向东流 任正非
*收稿日期：2021-01-26 修回日期：2021-03-20
基金项目：国家自然科学基金(31970794,32000586)
* 通信作者(corresponding author) ：likai@ ibms.pumc.edu
(中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京100005) 摘要：目的探究CRISPR/CasRx 介导的RNA 水平的基因敲降在小鼠精原细胞系GCl-spg 的应用。方法利用同源 重组的方法构建 EFla core promoter. CasRx. SV40. U6. DRs 表达质粒(CasRx-gRNA)和 EFla. EGFP,EFla. mCherry 、 EFla. tdToamto 3种荧光蛋白表达质粒。在人胚肾细胞系HEK-293T 内瞬时转染3种荧光蛋白表达质粒和CasRx- gRNA 表达质粒，通过荧光强度、Western blot 检测外源基因(荧光蛋白、EGFP 和mCherry)的敲降情况。在HEK-293T
细胞内转染CasRx-gRNA，通过q-PCR 检测内源基因mRNA 和IncRNA 干扰后的表达水平。在小鼠精原细胞系GC1 内瞬时转染外源基因eg 加、mCherry 和CasRx-gRNA 表达质粒并通过以上方法检测外源基因(荧光蛋白)沉默效率。结 果 成功构建了 CasRx-gRNA 和3种荧光蛋白表达质粒。在HEK-293T 细胞内CRISPR/CasRx 介导的RNA 干扰外源
基因(e 曲、mCherry )和内源基因(mRNA 、lncRNA )后，表达水平均显著下调(P<0.01)o 在小鼠精原
细胞系GC1内验 证CRISPR/CasRx 系统，可有效和特异敲降外源基因e 加、mCherry 。结论CRISPR/CasRx 系统能够在GCl-spg 细胞中
发挥有效和特异的敲降作用，为雄性生殖发育的研究提供新的基因沉默工具。
关键词： CRISPR/CasRx ； RNA ；敲降；GCl-spg 中图分类号:R34
文献标志码:A
Application of RNA-targeted CRISPR/CasRx
system in mouse spermatogonia cell line GC 1 -spg
LI Meng-zhen,LIU Jun,ZOU Ding-feng ,MIAO Shi-ying ,WANG Lin-fang ,SONG Wei,LI Kai *
(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology , Institute of Basic Medical Sciences CAMS ,
School of Basic Medicine PUMC ,Beijing 100005,China)
Abstract : Objective To investigate the application of CRISPR/CasRx mediated gene knockdow
n at the RNA level
in mouse spermatogonia cell line GCl-spg. Methods The EFla core promoter. CasRx.SV40.U 6.DRs expression
plasmid ( CasRx-gRNA) and three fluorescent protein of EFl a. EGFP , EFl a. mCherry , EFl a. tdToamto expression
plasmids were constructed by homologous recombination ・ Three fluorescent protein expression plasmids and CasRx- gRNA expression plasmids were transiently transfected into human embryonic kidney cell line HEK-293T, and the
knockdown of exogenous gene (the fluorescent proteins , EGFP and mCherry) was used to detect by fluorescence in tensity and Western blot. Additionally , the expression levels of endogenous gene (mRNA and IncRNA) were meas
ured by q-PCR in HEK-293T cells transfected with CasRx-gRNA. The exogenous gene egfp 9 mCherry and CasRx- gRNA expression plasmids were transiendy transfected into the mouse spermatogonia cell line GC1, and the knock
down efficiency of exogenous gene (the fluorescent proteins) was detected by the above method ・ Results CasRx-
gRNA and three kinds of fluorescent protein expression plasmids were constructed successfully. After CRISPR/CasRx
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mediated RNA interference of exogenous genes(egfp,mCherry)and endogenous genes(mRNA,IncRNA)in HEK-293T cells,the expression level was significantly reduced(P<0.01).The CRISPR/CasRx system was verified in the mouse spermatogonia cell line GC1,which could effectively and specifically knock down exogenous genes egfp and mCherry.Conclusions CRISPR/CasRx system exerts an effective and specific knock-down function in GCl-spg,providing a new gene silencing tool potentially used in the study of male reproduction.
Key words:CRISPR/CasRx；RNA；knockdown；GCl-spg
成族规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/CRISPR关联因子（CRISPR associated, Cas）系统是细菌和古细菌物种抵御入侵的噬菌
体和核酸中的外来遗传元件的一种免疫应答方式⑴，其通过各种CRISPR/Cas系统的RNA引导的核酸内切酶结合和切割外来遗传元件而发挥作用⑵。尽管在先前的报道中，CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用于在DNA层面进行基因编辑以剖析特定遗传元件的功能或纠正致病突变⑶，但当不适合对基因组DNA进行永久修改（例如敲除致死）以及涉及生物安全问题时，或者用于RNA病毒感染疾病（例如SARS-CoV-2感染）⑷时,RNA靶向基因编辑技术就尤为重要。CasRx是CRISPR系统中鉴定出的一种新的、由RNA引导的、靶向RNA的Cas核酸酶，其能够实现对转录组高效和特异的敲降⑸。迄今为止,CRISPR/CasRx介导的基因沉默已经被广泛使用，例如抑制胰腺导管腺癌的发生发展岡小鼠中用于神经细胞命运操纵⑺、肝脏代谢调节⑷、预防新血管形成以及植物⑻和胚胎⑼中特异基因敲降。尽管RNA靶向的CRISPR/CasRx系统具有广泛的应用前景，但是在雄性生殖领域中还未有相关应用的报道。本项研究验证了CRISPR/CasRx在HEK-293T细胞中可敲降egfp（enhanced green fluorescent protein）和mCherry外源基因，以及特异敲降HEK-293T细胞内源基因，包括mRNA和IncRNA（long non-coding RNA）。为了评估CRISPR/CasRx系统在雄性生殖领域中的应用潜力，选取了GCl-spg细胞并利用该系统靶向egfp和mCherry外源基因进行了验证。 1材料与方法
1.1材料
开放式数控系统人胚肾细胞系293T（human embryonic kidney cell line,HEK-293T）、小鼠精原细胞系GCl-spg（本课题组保存）；EFla.CasRx.2A.EGFP、CasRx.pregRNA cloning backbone（武汉淼灵生物科技有限公司）；lenti.Guide.mCherry、lenti.Guide.tdTomato（王晓月教授馈赠）；DMEM高糖培养基（HyClone公司）；Fatal bovine serum（Gibco公司）；Opti-MEM培养基、penicillin-streptomycin（Life Technologies公司）；Q5Hot Start HiFi PCR Master Mix、T4DNA Ligase（NEB公司）；5xDNA loading dye（Generay公司）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Master Mix A Fast Digest Pac I（Thermo Fisher Scientifical公司）；PEI（Polysciences公司）；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒中提试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；SDS-PAGE快速凝胶试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司）;E.coli Trans5a Chemically Competent Cell（TransGene Biotech公司）；EcoR I（TaKaRa 公司）；GFP antibody（Cell Signaling公司）；mCherry antibody（Proteintech公司）；引物（北京擎科生物科技有限公司合成，见表1,2）；gRNA序列（北京天一辉远生物科技有限公司合成，见表3）。
1.2方法
1.2.1质粒的构建：利用SnapGene设计lenti. EFla.EGFP、lenti.EFla.mCherry、lenti.EFla.tdTo-mato目的质粒,Q5高保真PCR Mix扩增目的片段，同时使用Pac I和EcoR I内切酶酶切慢病毒表达载体，纯化回收目的片段。使用同源重组酶连接目的片段和载体，转化E.c。％Trans5a感受态细菌内，12h后
挑取单克隆菌落，送擎科公司进行测序，比对测序结果后，质粒提取。同上方法,PCR获得EFla core promoter、CasRx、SV40、U6-DRs和载体片段，连接到AAV表达载体，测序比对后质粒提取。
1.2.2瞬时转染：在6孔板培养皿内铺约106个细胞,17h后换液。配置转染试剂，按照1:1的比例加入Max转染试剂，静置30min后滴加入培养基内, 24h后换为正常的DMEM,48h后收细胞进行检测。
李梦真RNA靶向的CRISPR/CasRx系统在小鼠精原细胞系GCl-spg中的应用655
表1PCR及测序引物序列
Table1Primers for PCR and sequenc
target gene primer sequence(5_3‘)
e曲F:TCGTGACGTACGGCCACCATGAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCA
R:ATAAGCTTGATATCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA
tdTomato F:AnTCAGGTGTCGTGACGTACGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCA
R:GATAAGCTTGATATCGAATTCITACrrGTACAGCTCGTCCATGCCGTACAGG
mCherry F:TCGTGACGTACGGCCACCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACA
R:GATAAGCTTGATATCGAATTCCTTGTAC A GCTCGTCC A TGCCGCC
U6-DRs F:CAAATGTGGTAAAATCGAGAGCATGGCTACGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCAT
R:ATGAAGGAATCATGGGAAATAGGCCCTCGTAGCCATGCTCTCGATHTACCACATrTG
EFla F:GCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCAATTC A TGAATTCGCTAGCTAGGTCTTGAAAGGAG
R:CTTCTTCTTGGGGCTCATGGTGGCACCGGTCCTGTGTTCTGGCGGCAAA
CasRx F:TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTGCCACCATGAGCCCCAAGAAGAAG
R:TTATCATGTCTGCTCGAAGCGGCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGCG
表2实时荧光定量PCR(q-PCR)引物序列Table2Real-time fluorescent quantitative PCR (q-PCR)primer sequence
表3gRNA序列Table3gRNA sequence
target gene primer sequence(5'3)
e曲mCherry
B4GALNT1 ANXA4 MALAT1
H19F:ACGTAAACGGCCACAAGTTC
R:AAGTCGTGCTGCTTCATGTG
F:CCTGTCCCCTCAGITCATGT
R:CCCATGGTCTTCTTCTGCAT
F:CTGAACTTCCACACCCTGTAG
R:GTCAGGATCAAGGAGCAAGTAG
F：CC1TGCCTACCGCAACA
R:TCAATTAGGCAGCCCTCATC
F:CCGTACTTCTGTCrrCC AGTTT
R:GAATTGCGTCATTTAAAGCCTAGT
F:GGAATCGGCTCTGGAAGGTG
R:TGGCCATGAAGATGGAGTCG
target gene
gRNA NT-l
gRNA町-2
gRNA NT-3
gRNA EGFP-l
gRNA sequence(5'・3')
TCACCAGAAGCGTACCATACTCACGAACAG
CTACCTGGTAGCCCTTGTATITGATCAGGC
TGCCACTACTGTTCATGATCAGGGCGATGG
GTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCITCAGCTC
gRNA EGFP-2CATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTT
gRNA EGFP-3TCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGG
gRNA血cherry-1
gRNA mCheny-2
gRNA B4GALNT1-1
gRNAjB4GALNTl亠
gRNA B4GALNT1-3
gRNA ANXA4-l
gRNA ANXA4-2
CGCCGCCGTCCTCGAAGTTCATCACGCGCT
GAAGCGCATGAACTCCTTGATGATGGCCAT
AGCGCACAGGGCCCGGCGGCCCAGCCACAT
CGCGTACAGGAGCCCCAGCGAGGCGCAGGC
CCTCCTGACCAGAAGCTGCCTGAAGGCTCA
CTTGTAGGCTGTCCTGATCTCCTGGCGCTG
AATTAGGCAGCCCTCATCAGTGCCGGCTCC
gRNA ANXA4-3CTTATGCGCCGGATCTCCTCAGGGGTCCGG
1.2.3细胞培养:HEK-293T细胞及GCl-Spg细胞均在DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清、1%青/链霉素）、5%CO2a37七恒温培养。
1.2.4gRNA设计及连接：gRNA设计于https：// ，将得分前3名的gRNA 进行比对之后合成。通过呦Z I内切酶酶切AAV.EFla.CasRx.U6.DRs载体以及合成的gRNA 片段,T4DNA
连接酶连接。
1.2.5Western blot检测蛋白的表达：用lxSDS 80|xL裂解细胞样品,100X变性,12000r/min离心gRNA MALAT1-l
gRNA MALAT1-2
gRNA MALAT1-3
GTATITATAGACGGAGAACAACTCGCATCA
CTTCTCCAAATTGlTrCATCCTACCACTCC
CTATCTTCTATACTTCTCCAATAC1TGTCT gRNA H19-l CACCCGTCATCACTCCTGCCAGACTCCAGA gRNA H19-2CTGCTGCAACTCCCCGAGCACTGCCTGTCT
g RNA H19-3AGAGCTCATTCACTCCGCCCCGCCCGCCTC
5min吸取上清，弃去细胞碎片，用BCA法进行蛋白定量。用10%SDS-PAGE快速凝胶试剂盒，加入蛋白样品，使用相应的抗体进行检测。
1.2.6q-PCR检测mRNA水平:1mL Trizol 加入细
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基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine
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胞沉淀内，加入异丙醇12 000 r/min 15 min 离心获 取沉淀，使用70%冰乙醇进行洗涤2遍，使用预热的
DEPC 水进行溶解。
1.2.7流式细胞分选术分析阳性细胞：使用0.25%
兵人模型
非诚勿扰英国专场胰蛋白酶将细胞消化下来后,PBS 洗涤细胞1遍，之 后使用40 yin 滤膜进行过滤，使用流式细胞仪进行
EGFP 和mCherry 阳性细胞的分选，使用Flowjo 软
件分析。
1.3统计学分析
统计及作图使用GraphPad Prism 6软件，图中
每组数据结果均以均数土标准差（无土s ）来表示，实验 组与对照组比较采用t 检验。
2结果
2.1构建CasRx-gRNA 表达质粒和荧光表达质粒
通过PCR 扩增获得对应长度的目的片段，测序 结果连接成功且无突变，经质粒提取获得EFla core
promoter. CasRx. SV4O. U6. DRs 质粒（图 1A,B ）O 通
过PGR 扩增获得对应长度的目的片段和酶切后的载
体片段，质粒提取获得3种荧光表达质粒（图1C ,D ）。
A
:RficCasl3d DR36RfxGaslBd DR ；T6
HA
SV40 NI.S 1
1
L
4000!1 __II ■
rrR
3'ITR
EF-l (xcorc promoter SV40 NLS
SV40 poly A
human UG promQl&r常熟理工学院学报
250 bp
匚
329 bp 315 bp 436 b P
B
EF-lo promoter
「 E GFP
EF- lo promoter
EF-la promoter
tdTomato
C
mCherry
D
A. AAV-CasRx-gRNA plasmid map ；
B. PCR products of EFla core promoter, SV4O, U6-DRs , CasRx, AAV-vector ；
C. EGFP, mCherry, tdTomato fluorescent protein expression vectors ;
D. PCR products of EFla promoter, EGFP,
mCherry , tdTomato
图1 CasRx-gRNA 和EGFP 、mCherry 、tdTonrato 荧光蛋白表达载体的构建
Fig 1 Construction of CasRx-gRNA and EGFP , mCherry , tdTomato fluorescent proteins expression
vectors
李梦真 RNA 靶向的CRISPR/CasRx 系统在小鼠精原细胞系GCl-spg 中的应用
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2.2 HEK-293T 细胞内验证 CRISPR/CasRx 系统
的特异性和高效性
通过网站设计以及文献查阅获得EGFP 和
mCherry 相应gRNA，将叹皿已问和叹皿时昨序列
插入 EFla core promoter. CasRx. SV40. U 氐 DRs 质粒
DR-DR 之间，获得目的质粒（图2A ）。在瞬时转染中氮肥
荧光蛋白表达质粒和CasRx+gRNA 48 h 后，检测3
种荧光的表达，其中EGFP 和mCheny 荧光为实验
组,tdTomato 为对照组，CasRx + gRNA EGFP CasRx +
gRNA mCheny 组EGFP 绿荧光和mCherry 红荧光
显著减弱,tdTomato 荧光强度不变（图2B ）。分别检 测EGFP 绿荧光和mCheiry 红荧光蛋白的表达 水平显著降低（图2C ）。
2.3 CRISPR/CasRx 系统在 HEK-293T 细胞系内
有效敲降内源基因
选取一组EK-293T 内源表达的蛋白质编码基
ITR
ITR
A
CasRx CasRx+gRNA EGfp CasRx+gRNA^
EGM*
mCherry
tdTomato
WT EGFP 百R na ^fp CasRx 一 一
一 十
一 一 + —
- +
+ +
ku EGFP
35
tubulin
**
65C
B
mCherry
gRNA mChci ^
呂RM®
CasRx 一
一 一 +一 一 十
一
一
+
4■ +ku
mCherry
*" 1
35tubulin
65
A ・ AAV-CasRx-gRNA plasmid design strategy ;
B ・ fluorescence expression after HEK-293T knockdown ( x20) ;
C ・ detection
of the expression of EGFP and mCherry protein level by Western blot; WT. wild type
图2 CRKPR/CasRx 在HEK-293T 细胞内靶向沉默外源基因的表达
Fig 2 CRISPR/C asRx targetedly silenced the expression of exogenous genes in HEK-293T
cells
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