磺胺类药物（sulfonamides ，SAs ）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和细菌感染性疾病的抗生素[1]。1935年磺胺类药正式应用于临床。具有抗菌谱广、性质稳定、体内分布广等优点。磺胺类药物在畜牧业，被广泛用于食源性动物疾病，同时可以添加到饲料中作为预防和促生长使用[2-4]。磺胺增效剂(sulfonamide potentiators, SAP)是指含有5-取代苄基-2，4-二氨基嘧啶的一类化合物，包括三甲氧苄氨嘧啶、二甲氧苄胺嘧啶和二甲氧甲基苄胺嘧啶等，多与磺胺合用使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，可以增加磺胺抗菌作用。磺胺增效剂与磺胺联合使用于畜禽养殖业中大肠杆菌引起的败血症、鸡白痢及球虫病等[4-6]。但是近年研究表明，该类药物存在较为严重的副作用，过量使用会导致其在动物源性食品中残留，会致使其在人体中蓄积，导致人类对许多细菌产生抗药性，从而对人类的身体健康造成很大的危害[7~9]。因此，很多国家对磺胺种类的使用和用量有严格的规定。我国农业农村部规定动物源性食品中的SAs 总量及磺胺二甲基嘧啶等单个SAs 的含量不得超过0.1mg/kg ，磺胺增效剂限量不得超过0.05mg/kg [10]。由于抗生素潜在的威胁，
液相谱-串联质谱同步检测饲料中
26种磺胺和3种磺胺增效剂
■宋占腾肖志明王石樊霞索德成*
the catalyst
(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京100081)
作者简介：宋占腾，硕士，研究方向为农产品质量与安全。通讯作者：索德成，副研究员，硕士生导师。收稿日期：2021-01-15
基金项目：国家自然科学基金项目[31572443]；农业行业标准制定和修订（农产品质量安全）项目[2017-215]
摘要：通过对提取、净化等前处理条件及LC-MS/MS 分析条件的优化，建立了多重机制杂质吸 附结合液相谱-串联质谱同步检测饲料中26种磺胺及3种常用磺胺增效剂的方法。该方法可同时检测饲料中29种磺胺类药物及其增效剂。饲料样品经1%甲酸乙腈溶液提取后，采用多重机制杂质吸附净化，经氮吹浓缩、定容，供高效液相谱-串联质谱分析。该方法回收率为63.4%~110.2%，标准偏差为0.4%~18.3%，检出限在5~50.0ng/g 之间。 关键词：液相谱-串联质谱；多重机制杂质吸附；饲料；磺胺；磺胺增效剂doi:10.13302/jki.fi.2021.06.011中图分类号：S816.17文献标识码：A 文章编号：1001-991X （2021）06-0052-08
Simultaneous Determination of 26Sulfonamides and 3Sulfonamide Synergists in Feed by Liquid
Chromatography Tandem Mass Spectrometry
SONG Zhanteng XIAO Zhiming WANG Shi FAN Xia SUO Decheng *
（Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agricultural Product ,Chinese Academy of
Agricultural Science ,Beijing 100081,China ）
Abstract ：A method for simultaneous determination of 26sulfonamides and 3sulfonamide synergists in feeds by LC-MS/MS with multi-function impurity adsorption cleaning was established .the extraction,puri⁃fication and LC-MS/MS conditions were optimized.The method can simultaneously detect 29sulfonamides and their synergists in feed.feed sample were extracted by acetonitrile with 1%formic acid,and purified by multi-function impurity adsorption cleaning.The elution was evaporated by nitrogen blow,dissolved and assayed by LC-MS/MS.In optimized method,The limit of detection were 5~50ng/g for sulfonamides and synergists.The recoveries were 63.4%~110.2%,and coefficients of variation were 0.4%~18.3%.Key words ：liquid chromatography tandem mass spectro
metry;multi-function impurity adsorption clean⁃ing;feed;sulfonamides;sulfonamide potentiators 52
美国FDA 从2017年开始禁止在牲畜饲料中使用预防性抗生素[11。2019年农业农村部发布194号公告，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料，磺胺和其增效剂正式在饲
料中禁用[12]
。作为常用的抗生素，饲料中磺胺和磺胺增效剂的测定技术是必不可少的。
国内外对磺胺类药物和增效剂的文献报道较多。主要有高效液相谱法(HPLC)[13-17]、酶免疫分析
法(EIA)[18-22]、液/质联用法(LC/MS)[23-30]
等。目前文献报道涉及的样品主要以动物组织和环境样品为主[15-32]，对饲料的检测报道相对较少。目前有关饲料中磺胺类药物检测方法标准主要包括《饲料中磺胺类药物的测定—高效液相谱法》（GB/T 19542—2007）和《饲料中9种磺胺类药物的测定高效液相谱法》（农业部1486号公告-7-2010），检测仪器主要集中以高效液相谱法为主，检测灵敏度低，无法作为确证检测技术，并且分析的药物覆盖面窄，不能满足现今磺胺类药物的监测要求。目前现有的磺胺类检测方法存在样品处理方法繁杂、费时、成本高等问题，不利于实现快速、简便、高通量、低成本筛查。同时目前尚缺磺胺类药物与磺胺增效剂的同步测定方法。为此，本文在查阅有关文献的基础上，建立了多重机制杂质吸附结合LC-MS/MS 同时检测和确证饲料中26种磺胺及3种磺胺增效剂的方法。1试验部分1.1仪器与试剂
Waters TQS 型高效液相谱-串联质谱仪[带有电喷雾电离源(ESI 源)]，购于美国Waters 公司；Waters BEH C18谱柱（100mm×3.0mm ，1.7μm ）、Waters CSH C18谱柱（100mm×3.0mm ，1.7μm ）、Waters TSS T3C18谱柱（100mm×2.1mm ，1.7μm ），购于美国Waters 公司。前处理吸附材料Cleanert S C8：粒径50μm ；Cleanert S C18：粒径50μm ；Cleanert S 硅藻土（SLE ）：粒径150μm ；Cleanert S 中性氧化铝（Al-N ）：粒径150μm ；Cleanert S 活性炭（Carb ）：粒径120~400mesh ；Cleanert S 纳米碳Nano Carb ：粒径10~20nm ，均购于博纳艾杰尔科技公司。吸附材料BONDESIL-SAX ：粒径40μm ；BONDESIL-SCX ：粒径40μm ；BONDESIL-NH2：粒径40μ
m ；BONDESIL-FL ：粒径200μm ；均购于安捷伦科技公司。磺胺类药物及磺胺增效剂分别购于Dr.Ehrenstorfer(Augsberg ，Germa⁃ny)、Sigma-Aldrich(Luckenwalde ，Germany)、Manhage Bio-technology Company(Beijing ，China)、中国兽医药品监察所（Beijing ，China ）。甲酸（谱纯，Sigma 公司）；乙腈和甲醇（谱纯，Fisher ChenAlert Guide 公司）；其他试剂均为分析纯试剂，试验用水为Mili-Q 纯
化后的超纯水（>18MΩ）。0.22μm 聚四氟乙烯(PT⁃FE)滤膜购于上海安谱实验科技股份有限公司。
多重吸附前处理吸附材料：称取2g BONDESIL-SAX 、3g Cleanert S C18、3g BONDESIL-FL 于50mL 三角瓶中，混合均匀，备用。1.2样品前处理
贺州水污染称取饲料样品5g （精确至0.01g ），加入20mL 1%甲酸乙腈溶液，超声提取30min ，以10000r/min 离心5min 。取上清液备用。
取3mL 上清液于10mL 离心管中，加入100mg 多重吸附前处理吸附材料，漩涡混合30s ，于10000r/min 离心2min 。将2mL 上清液转移至10mL 离心管中，40℃氮气吹干，加入0.5mL 甲醇+0.1%甲酸溶液（10+90），漩涡混合30s ，过0.22μm 滤膜，上LC-MS/MS 测定。若样品中含量超出线性范围，用样品稀释液稀释至线性范围内上样。1.3谱和质谱条件
谱柱：Waters CSH C18柱（100mm ×2.1mm,1.7μm ）；柱温25℃；进样量5μL ；流动相流速为0.3mL/min ，梯度淋洗，流动相组成和梯度见表1。
质谱采用电子喷雾离子源，正离子检测方式，多反应监测（HRM ）；喷雾电压为3.5kV ；毛细管温度为550℃；脱溶剂气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气，使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。具体的参数见表2。2结果与讨论
2.1谱和质谱条件
参考文献，本试验中比较了3种具有不同选择性的UPLC 谱柱Waters BEH C18(100mm×3.0mm ，1.7μm)、Waters HSS T3C18(100mm×2.1mm ，1.7μm)、Waters CSH C18（100mm×3.0mm ，1.7μm ）进行分离比较。其中HSS T3C18分离效果较差；BEH 对磺胺米隆无保留，同时饲料中一些杂质对部分磺胺类药物有干扰，部分磺胺类药物峰型拖尾。因此采用Wa⁃ters CSH C18柱克服了大多数C18柱在低离子强度流动相条件下因载量所导致的拖尾问题。提高了有效的提高了磺胺类药物和增效剂分辨率。
大部分液相谱检测磺胺类药物和其增效剂均采用以甲醇/乙腈+甲酸水/醋酸水体系作为基本流动相条件，本试验考察了磺胺类药物和其增效剂在上述流动相梯度条件下的谱行为。结果表明：乙腈和水溶液作为流动相时，三种同分异构的磺胺类药物（磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶）
和两种同分异构的磺胺类药物（磺胺胍、磺胺醋酰）无法通过
53
表1
流动相梯度条件
表2磺胺和磺胺增效剂的质谱条件
54
调节梯度达到满意的分离效果，因此选择了0.1%甲醇和0.1%（V/V ）甲酸水溶液作为流动相。同时通过梯度洗脱，可以在10min 内有效分离29种药物，缩短了保留时间，在很大程度上节省了溶剂消耗，降低了分析成本和废液产生。同时明显提高了分离效应，有效缩短了分析周期，具体谱图见图1。同时为了避免干扰，采取分段采集的方式，有效的提高灵敏度和杂质干扰。2.2提取条件选择
磺胺类药物和其增效剂的结构和性质差异不大，根据文献，有机溶剂（乙腈、甲醇）提取各种类型磺胺类药物和其增效剂有较好的回收率，王恒等[17]研究了7种提取液对动物源性食品中磺胺类药物的提取效率，结果基本无差异。但杂质提取量有所区别，乙腈类的提取效果好于乙酸乙酯的提取效果，二氯甲烷是最好的提取溶剂。为了获得尽可能高的回收率，本试验分别选用甲醇、乙腈、水/乙腈、二氯甲烷作为提取溶剂。以二氯甲烷作为提取液提取时，饲料中大量脂溶维生素被二氯甲烷提出从而影响
了药物回收率。甲醇提取杂质较高，下一步净化效果不明显。综合考虑，选择了乙腈作为提取液。同时，发现在乙腈中加入一定量的甲酸能提高磺胺增效剂的回收率，同时甲酸可使磺胺类药物和其增效剂在酸性条件下更易形成正离子，有利于质谱分析。为此最终选择20mL 1%甲酸乙腈溶液作为提取溶液。
2.3多重机制杂质吸附净化的条件选择
选择磺胺和磺胺增效剂与10种吸附材料（具体见表3）进行了吸附性能研究试验。具体步骤如下：取配合饲料25g ，加入100mL 提取液，离心，将上清液转移至试剂瓶中，分别吸3mL 提取液，加入0.3mL 1μg/mL 磺胺和其增效剂标准溶液，分别加入100mg 各种吸附材料，漩涡混合30s，在摇床上振荡15min ，10000r/min 离心5min ，取上清液过膜，上机检测，同时吸取3mL 提取液，不加入吸附材料作为空白参考。用测定值与空白参考值计算回收率。吸附结果见图2，虽然部分吸附材料对某些磺胺类药物和其增效剂有明显的吸附（回收率小于10），但是其对磺胺类药物和增效剂吸附率不能达到100%，无法作为富集材料使用。同时我们没有发现一种洗脱液能有效洗脱吸附在材料上的磺胺类药物和其增效剂。然而，从图2可以看出吸附材料能吸附大量干扰物质，降低了基质效应。使处理后回收率高于空白提取液。因此，最终采用多重机制杂质吸附技术(multi-function impurity adsorption cleaning ，MIA)来净化样品。多重机制杂质吸附技术是一种最新提出的基于介质分散固相萃取的方法，该方法主要通过选择多种功能化吸附材料，将样品中的主要干扰杂质吸附，有效地去除基体中可
能存在的磷脂、素等物质，同时将被测物质留在样品溶液中，而达到净化和富集的目的，可大大节省样品前处理的时间。从吸附机理上来看，C8和C18是主要靠非极性碳键相互作用，有助于对非极性吸附过程的样品的洗脱反相萃取，主要吸附于磷脂和中等极性的化合物，由于C8碳键较C18短，所以吸附杂质能力弱于C18，因此选择了C18作为候选材料；氨基（NH 2）是硅胶基质上键合极性氨基丙基的极性吸附剂，而且同时具有氢键和阴离子交换两种作用机理，可用于从极性样品当中分离其非极性分化合物；SAX 为硅胶上键合卤化季铵盐的吸附剂；与NH 2吸附机理相似，相比NH 2，SAX 吸附杂质效果更好。弗洛里硅土为硅胶键合氧化镁的吸附剂，主要用于去除部分素和大分子物质。因此选择C18，弗洛里硅土，SAX 作为多重机制杂质吸附材料，通过混合使用可以有效的去除饲料中各种杂质干扰，达到更好的净化效果。将各种材料按不同比例添加进行净化研究，从基质净化效果来，SAX 、弗洛里硅土和C18的比例为2 2 3，能有效地吸附杂质，降低基质效应。
同时考察了吸附材料的使用量对净化效果的影响，比较了10、20、50、100、200、500mg 不同固体吸附剂加入量对3mL
饲料提取液中杂质净化效果的影
表2（续）磺胺和磺胺增效剂的质谱条件
注：“*”表示定量离子。
55
响。结果表明，当固体吸附材料加入量达100mg 时，
继续加大吸附剂的用量对饲料样品杂质的净化效果
和回收率无明显改善。因此将吸附材料加入量设定为100mg 。当加入吸附剂吸附净化后，可以有效地除
注：29种药物由上向下分别为：1.磺胺米隆(Mafenide)；2.磺胺胍(Sulfaguanidine)；3.磺胺(Sulfanilamide)；4.磺胺醋酰(Sul⁃phacetamide)；5.磺胺二甲异嘧啶(Sulfisomidine)；6.磺胺嘧啶(Sulfadiazine)；7.磺胺噻唑(Sulfathiazole)；8.磺胺吡啶(Sulfa⁃pyridine)；9.二甲氧苄氨嘧啶(Diaveridi
ne)；10.磺胺甲嘧啶(Sulfamerazine)；11.三甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim)；12.磺胺二甲唑(Sulfafurazole)；13.磺胺对甲氧嘧啶(Sulfametoxydiazine)；14.磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole)；15.磺胺二甲基嘧啶(Sul⁃famethazine)；16.二甲氧甲基苄胺嘧啶(Ormetoprin)；17.磺胺甲氧哒嗪(Sulfamethoxypyridazine)；18.磺胺氯哒嗪(Sulfachlo⁃ropyridazine)；19.磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole)；20.磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)；21.磺胺邻二甲氧嘧啶(Sulfa⁃doxine)；22.磺胺二甲异恶唑(Sulfisoxazole)；23.磺胺苯酰(Sulfabenzamide)；24.磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole)；25.磺胺氯吡嗪
(Sulfachloropyrazine)；26磺胺吡唑(Sulfapyrazole)；27.磺胺间二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine)；28.磺胺喹恶林(Sulfaquinoxa⁃line)；29.磺胺硝苯(Sulfanitran)。
图129种磺胺类药物和磺胺增效剂谱图（1.标准样品；2.空白饲料样品；3.饲料添加回收）
(%)
2.00
3.00
4.00
10.0
1.00
1000
5.00
6.00
第欧根尼7.00四川卫生厅
8.00
9.00
2厄尔尼诺事件
时间(min)
时间(min)
(%)
2.00
3.00
4.00
10.0
1.00
1000乙烯基三乙氧基硅烷
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
1
(%)
2.00
3.00
4.00
10.0
1.00
1000
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
3
时间(min)
56
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