本项目获国家自然科学重点基金资助。!为通讯联络人。
周冬梅邹汉法!倪坚毅杨利贾凌云张玉奎
（中国科学院大连化学物理研究所
国家谱研究分析中心
大连!!(&!!
）摘要
以甲基丙烯酸缩水甘油酯$纤维素复合膜为基质，分别以蛋白)（*+,-./0)）noetv
、人免疫球蛋白1（2341）、三嗪染料（5/678+,069:.;’1)）、亚胺二乙酸$铜离子为配基，用不同方法制备了适合于分析及小量制备的高效亲和膜谱介质，并对高效亲和柱的基本性能及其应用于各种相应蛋白的定量测定情况进行了考察。利用这种方法可以针对不同的目标蛋白及所存在的环境采用不同的配基，对各种蛋白的定量测定及小量制备可达到较为满意的结果。
关键词高效亲和膜谱，介质制备，蛋白质的快速分析，蛋白质的小量制备
学科分类号<=&’
近年来，随着生命科学、生物技术、药学以及医疗技术的日益发展，对活性生物大分子的分析、分离和纯化的要求也越来越高。在一个生物工艺流程中，对各种组分快速的在线分析往往是必需的。亲和谱是吸附谱的一种，是基于优异生物特异性作用基础上的分离方法。理论上所有的生物大分子均可利用亲和谱得到分离和纯化。由于亲和谱的特异性很高，因而非常适合于复杂的生物大分子体系中某种物质的分离和分析。但是经典的亲和谱由于其基质的限制，柱效较低，在流速为!>&?9／?/0时，
峰宽常常达到@?/0以上［!］
，因而很难用于生物大分子的分析。美国博大*.+A .B -/C .6/,A D
A -.?公司于!""@年推出的*.+E :A /,0谱基质是一种较为理想的谱基质［@］
，我们曾采用以*.+E :$A /,0为基质的灌流亲和谱分析分离单克隆抗体［’，F ］
。流速为!
>=?9／?/0时，峰宽只有&>’?/0。但这种基质非常昂贵，一根@&??G &>@??（3>H >）的谱分析柱价格在!&&&美
元以上。我们研制了一种适合于亲和分析的膜亲和基质，并与高效液相谱仪配套使用，利用=种不同的配基对它进行了系统的研究。流速为!>&?9／?/0时，峰宽可以达到&>F ?/0，一次分析只需=?/0。快速分析中一次只需’&A
，使得对时间要求严格的在线分析成为可能。我们还对亲和柱用于蛋白质的小量制备进行了考察。
!材料和方法
!"!仪器和试剂
I 7-.+A =!&高压液相谱泵，J *@&&紫外检测器，I H K $"#谱工作站（国家谱研究分析中心）；蛋白)样品由美国5L M N 公司惠赠，
人免疫球蛋白1标样（军事医学科学!F 卷F 期!""%年!&月生物工程学报
!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12
O ,9P !FM ,P F
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卷
院），过氧化氢酶（东风生物技术公司）、亚胺二乙酸（美国!"#$%公司），三嗪染料汽巴蓝（&"’%()*+’,-./012）（北京华美公司），羊抗人免疫球蛋白1（34#1，卫生部上海生物制品研究所），人血浆（大连妇产科医院）；所用的水为5",,"67水；其它试剂均为分析纯的化学试剂。
!"#甲基丙烯酸缩水甘油酯（152）复合纤维素膜的制备
制备复合膜的过程如图8：首先采用甲基丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应制得聚合物，再与纤维素进行接枝反应，制得纤维素复合膜［9］。然后再根据配基的不同采用不同的合成方法。
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的
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寄存器传输级丙
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柱上样液为!"##$%／&’()*+,-%（.
,/01"），洗脱液为上样液含!#$%／&23-%［4］。灵敏度为"156789。上样后，先用上样液冲洗:#);，然后改用洗脱液冲洗:#);
。!"#蛋白6高效亲和膜谱制备柱对,<=
>的吸附量及非特异性吸附的测定蛋白6高效亲和膜谱柱的非特异性吸附用亲和膜对?96的吸附来衡量。将过量,<=>或?96样品循环上样!"#);，然后用洗脱液将膜谱柱吸附的,<=>或?96洗脱下来，收集洗脱液，用紫外分光光度计检测,<=>的含量。!"$分析型高效亲和膜谱柱的非特异性吸附的测定
称量?96样品，用上样液配制成5#=／#%的溶液，在上述谱条件下，上样:"!%。!"!%人血浆中&’(
)的定量测定!"!%"!定量标准曲线的测定：于实验前准确称量冻干标准品，用上样液配制成!1:5、:15"、@105、51""、!"1""、:"1""#=／#%的标准样溶液，准确吸取:"!
%进样，以峰面积对进样量进行线性拟合得出定量标准曲线。
!"!%"*,<=
>的定量测定：将冰冻保存的人血浆用@0A 的水浴融化，用上样液稀释!"倍。将稀释!"倍的人血浆上样:"!%，根据所得峰面积进行标准曲线定量。!"!%"+,<=>的快速定量测定：将流速提高到@1"#%／#)；并相应改变冲洗梯度，分别将标准,<=>的溶液和稀释!"倍的人血浆上样:"!
%，并进行单点定量。*结果和讨论
*"!柱压与流速的关系
高效液相膜谱柱中柱压与流速的关系如图:。由图中可见，流速在"1"""15#%／#)；的范围内，柱压为"；在"15"@1"#%／#)；的范围内，柱压的变化基本是一条直线，
而不是像琼脂糖基质那样有一个压力的突升。
图蛋白
高效亲和膜柱上柱压与流速的关系
期周冬梅等：高效亲和膜谱快速分析及小量制备蛋白质
检测不出来。
!"#蛋白$高效亲和膜谱柱定量测定及制备人血浆中%&’
(!"#")定量测定!"#$的线性关系：标准样溶液进样%&!’所得的谱图如图(（)）。由图(可见，高效亲和膜谱柱的柱效很高，在流速为*+&,’／,-.时，半峰宽只有&+%,-.
。所得定量标准曲线的线性相关系数为&+///。!"#"!人血浆中!"#$的定量测定：将稀释*&倍的人血浆上样%&!
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所得的谱图如图(（0
异组和!"!"#为得&+D
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表!方法的重复性
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!"A 方法的重复性
在不同配基的柱子上，用不同的标样及人血浆样品进行了方法重复性的考察，所得的数据如表I ，由表中可见，标样H 次进样、人血浆样品=次进样的相对标准偏差均在=8I Q 以下。综上所述，所制备的复合膜介质具有非特异性吸附低、机械性能好、耐压高等优点，与液相谱仪配
套使用，可应用于各种相应蛋白的定量测定及小量制备。将各种被测蛋白的峰面积对进样量进行线性拟合，所得的线性相关系数均在;8??I 以上；重复进样所得的相对标准偏差均在H 8;Q 以下（标样07H ，实际样品07=）。当流速为:8;K +／K ’0时，一次分析所需的时间为H K ’0；快速分析中只需=;J 。含间隔臂己二胺的蛋白E 高效亲和膜谱柱用于从=
?=>期
周冬梅等：高效亲和膜谱快速分析及小量制备蛋白质
!"!#$%&；不含间隔臂的蛋白’高效亲和膜谱柱用于从人血浆中制备小量()&*，一次最多可制备!"+,%&；它对-.’的非特异性吸附基本检测不出来。我们所建立的这种蛋白快速分析及小量制备的方法非特异性吸附小，精确度高，重复性好，柱效高，分析速度快；针对不同的目标蛋白，可以选择不同的配基及分离条件，是一种适合于多种蛋白的快速分析及小量制备的方法，在生物工程、生物化学、药学等方面有着广阔的应用前景。
参
考
文
献
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周冬梅，杨利等P 高效亲和膜谱分析用介质及其合成方法，中国专利申请号,B +++,!N "#，+,,B
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