P(GMA-co-MMA)磁性复合微球的制备及木瓜蛋白酶的固定化 任琦;陈秋云;倪忠斌;陈明清仇玉
【摘 要】Poly(glycidyl methacrylate)-co-poly (methyl methacrylate) P(GMA-co-MMA) magnetic composite microspheres with epoxy groups on their surfaces were prepared by emulsion polymerization in the presence of oleic acid-coated Fe3O4 nanoparticles as magnetic resources. The morphologies, diameter, magnetic content and magnetic properties of the resulting composite microspheres were identified. Amino groups were introduced onto surfaces of the magnetic microspheres through surface modification. Papain was immobilized on magnetic microspheres by cross-linked reaction with glutaraldehyde. And the effects of amount of enzyme and concentration of glutaraldehyde on the activity of immobilized enzyme were studied. The properties of immobilized enzyme were also investigated under different temperature and pH. The results show superparamagnetic microspheres have a mean size of 170 nm and the magnetic content can be controlled from 20％ to 50％. The optimum immobilized conditions reached when th
e amount of enzyme was 200mg and concentration of glutaraldehyde was 4％.Compared with free papain, the immobilized papain possessed good pH and thermal stability, the durability has been improved as well.%在改性Fe3O4纳米颗粒存在的条件下用乳液聚合法制备了表面带有环氧基的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯一聚甲基丙烯酸甲酯P(GMA-co-MMA)磁性复合微球,对其粒径、形态、磁含量、磁性质进行了表征;在复合微球表面引入氨基后,以戊二醛为交联剂,固定木瓜蛋白酶,探讨了给酶量、戊二醛浓度对固定化酶活性的影响,考察了酶学性质.结果表明,该复合微球的平均粒径为170nm,具有超顺磁性,磁含量可以控制在20%～50%之间;当戊二醛浓度为5%,给酶量为200mg时,达到固定化酶最适使用条件,其在热、酸碱和操作稳定性上均优于游离酶. 【期刊名称】《功能材料》
【年(卷),期】2011(042)004
【总页数】4页(P730-733)
中国农民专业合作社网【关键词】甲基丙烯酸缩水甘油酯;乳液聚合;磁性复合微球;固定化酶
【作 者】任琦;陈秋云;倪忠斌;陈明清
【作者单位】江南大学,化学与材料工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,化学与材料工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,化学与材料工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,化学与材料工程学院,江苏,无锡,214122
【正文语种】中 文
【中图分类】O63;O61
磁性复合微球不仅有聚合物的特性，同时具有磁性，可在外加磁场的作用下实现有效的移动，用于快速分离，当撤去外加磁场微球可重新分散，因此其常被用作高效载体，在固定化酶［1，2］、蛋白质分离［3，4］等生物领域中广泛应用［5，6］。传统固定化酶主要有物理吸附法［7］和共价结合法［8，9］，物理吸附法是通过氢键、静电等物理作用力将酶固定于不溶性载体上，但是，酶和载体间的吸附力较弱，当体系的pH，盐浓度及温度变化时容易脱吸附。共价结合法是通过在固相载体表面引入羟基［10］、氨基［11］、羧基［12］、羰基［13］等活性基团，和酶分子之间形成化学共价键，使酶固载，不易脱落，
因此共价结合法是目前最常用的方法。在磁性复合微球的研究中，磁含量是衡量其特性的重要性质之一，不同磁含量的复合微球对外加磁场显示出不同的磁响应速度，因此制备磁含量高且可控的磁性复合微球是一个值得研究的课题。
本文在制备改性Fe3O4纳米颗粒的基础上［14］，通过甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）和甲基丙烯酸甲酯（MMA）的乳液聚合制备磁含量可控的复合微球，对其表面进行化学改性引入氨基，并通过共价偶联剂戊二醛与酶分子的希夫碱反应，将木瓜蛋白酶固定在磁性复合微球表面，探讨固定化酶的优化条件，考察固定化酶的酶学性质。
双光束紫外可见分光光度计（UV），UV－1100型，北京瑞利分析仪器公司制造；透射电子显微镜（TEM），JEM－2100型，日本JEOL公司；热重分析仪，TGA／SDTA 85e型，瑞士Mettler Toledo公司；磁强计（VSM），EV7型，美国ADE公司。
甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA），Acros Oganics公司，直接使用；甲基丙烯酸甲酯（MMA），国药集团化学试剂有限公司，用Al2O3柱除去阻聚剂；过硫酸钾（KPS），国药集团化学试剂有限公司，重结晶后使用；二乙烯苯（DVB），工业级，直接使用；三氯醋酸（TCA），NH3·H2O（28%（质量分数）），戊二醛（GA），十二烷基苯磺酸钠（S
DS），酪蛋白，木瓜蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司，直接使用。
将1g改性Fe3O4纳米颗粒加入溶解有0．24g的SDS的水溶液中，将混合溶液移入装有搅拌器、回流冷凝管的250mL四口圆底烧瓶中，充分搅拌乳化30min，加入含有2．1g MMA，0．6g GMA与0．3g DVB的混合单体，通氮除氧30min，升温至70℃后加入0．06g引发剂KPS，反应24h。对产物进行磁分离，用水洗涤3次，得到P（GMA－co－MMA）磁性复合微球。
量取5mL的NH3·H2O（28%（质量分数））加入到装有P（GMA－co－MMA）磁性复合微球的三口烧瓶中，在60℃下搅拌反应6h，对环氧基团进行改性，转变为氨基，反应结束后产物用大量去离子水冲洗至中性。根据文献［15］的方法，采用线性电位滴定法测定表面氨基含量。
在氨基磁性复合微球中加入5%的戊二醛溶液，室温振荡交联2h，磁分离，水洗去过量的戊二醛，再用1mol／L的磷酸缓冲液洗涤3次。取上述磁性复合微球10mg，加入10mL（10mg／mL）的木瓜蛋白酶溶液，室温下振荡固定2h，磁分离，然后用1mol／L的磷酸缓冲液和超纯水分别洗涤3次，得到固定化木瓜蛋白酶。
根据SB／T 10317－1999商业标准中的酶活力测定方法进行，自由酶活力为U／mL，固定酶活力为U／g，相对酶活力x为（U／g）／（U／g）max和（U／mL）／（U／mL）max。
中世纪欧洲地图在磁性复合微球中，磁含量是衡量其特性的重要性质之一，因此，通过一定方法控制磁性复合微球中的磁含量是非常重要的。图1是P（GMA－co－MMA）磁性复合微球的TGA曲线。图中（a）、（b）、（c）和（d）分别是油基Fe3O4纳米颗粒和单体的投料比为1／1、1／2、1／3和1／4的4种复合微球的热失重曲线。从图1中可以看出，磁性复合微球的失重与投料中的单体的量成正比，即随着油基Fe3O4纳米颗粒与单体的投料比的增加，磁性复合微球的磁含量逐渐增加。通过调节Fe3O4纳米颗粒与单体的比例，能有效制备磁含量为20%～50%的复合微球。图2是磁性复合微球的TEM照片，从照片中可以看出微球球形规整，粒径在170nm左右。
磁响应性是磁性复合微球应用于生物分离领域的一个重要特性。图3为磁性复合微球在室温下的磁滞回线。从图3中可以看出，P（GMA－co－MMA）磁性复合微球的矫顽力为零，并且没有磁滞现象，这表明所制备的磁性微球呈现超顺磁性。
P（GMA－co－MMA）磁性复合微球表面环氧基经过化学改性后转变为氨基，微球表面氨基含量对于木瓜蛋白酶的固定量有直接影响，因此，测定磁性复合微球表面氨基含量有重要的意义。
线性点位滴定的函数关系式为：
当强酸滴定强碱时，可以简化为下式：
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其中，V为滴定液的体积；V0为被滴定液的体积，此处指HCl标准溶液的体积；NB为滴定液的浓度，此处指NaOH标准溶液的浓度；［H＋］和［OH－］分别为H＋和OH－的浓度。根据公式（1）求出f（V）随V变化的曲线，曲线与V轴的交点即为实际消耗碱的体积V。计算所得磁性微球中氨基含量为431μmol／g。这种通过微球表面修饰得到氨基的方法能避免带有氨基功能基团的单体在聚合过程中的氨基损耗［14］，得到氨基含量更高的磁性复合微球。
木瓜蛋白酶通过戊二醛交联固定于氨基磁性微球表面，从图4可知，随戊二醛浓度的增加，酶活力先升高后降低，当戊二醛浓度为4%时酶活力达最大。
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当交联剂戊二醛的浓度过低时，酶的固载量很低，而浓度过高时戊二醛可能发生自身交联，使酶的固定效率降低，从而导致酶活力下降。
保持磁性复合微球的量为0．1g，从40～240mg改变给酶量，得到的固定化酶活力与给酶量的关系如图5，由图5中看出，固定化酶的活力随给酶量的增加而增加，当给酶量达到200mg时，酶活力最高，此时再继续增加给酶量，酶活力没有明显变化，这说明磁性复合微球活性基团结合位点趋于饱和。
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图6为温度对固定化酶和游离酶活力的影响。由图6可见，固定化酶和游离酶的最适温度分别为55和45℃。在75℃时固定酶的活力为55℃的87．34%，而游离酶在75℃时的活力只有最高活力的73．63%。与游离酶相比，固定化酶的最适使用温度提高了10℃，且在较宽的温度范围保持了活力。可见，固定化酶受温度影响较游离酶低，这可能是因为酶构象及活性中心随固定化的改变而改变，固定化提高了酶构象的稳定性，有利于固定酶在相对较高的温度下使用。
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