丁明玉，彭虹，郑睿白马湖之冬
（清华大学化学系，北京，100084）
摘要：在0.32mm的弹性石英毛细管内，制备了聚合物基质的毛细管整体柱。优化了试剂配比、反应时间等合成条件，制备出了大孔径且孔径均一的甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱。用亚胺基乙二酸对整体柱进行改性，得到了弱酸型阳离子交换整体柱。考察了改性时间、改性温度和pH值与离子容量的关系，并将该整体柱用于蛋白质的分离。 关键词：离子谱，毛细管整体柱，甲基丙烯酸，弱阳离子交换
毛细管整体柱微柱液相谱在生物物质分离以及与质谱等仪器的联用上显示出了优越的性能，因而成为近年谱的一个热点研究领域。目前有关离子谱整体柱的报道大多是在常规尺寸（4.6mm ID）的商品无机硅胶整体柱上进行修饰，用于无机阴、阳离子的分离分析。用于离子性成分分离的毛细管离子谱整体柱的研究还很少。Yuji等[1]报道在250μm内径毛细管内原位聚合有机整体柱，分离了一价和二价阳离子。Haddad等[2]在250μm石英毛细管柱内制备聚合物整体基质后，在其表面涂敷季铵功能化乳胶颗粒，30s内分离了无机离子和有机酸。以往报道的弱阳离子交换整体柱通常采用两步法改性，即先用乙二胺处理，再和反应。我们利用亚胺基乙二酸进行一步改性，简化了合成步骤。
1 实验部分乡愁赏析
1.1 仪器与试剂
加厚0.32mm ID（0.69mm OD）弹性石英毛细管柱(河北省永年锐丰谱器件有限公司),KYKY 2800 扫描电镜(中国科学院北京科学仪器研制中心),AutoPore IV 9510汞渗透测孔仪(美国Micromeritics Inc.)。
甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，东京化成工业株式会社），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，Acros Organics，USA），γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS，东京化成工业株式会社）；正丙醇和1，4-丁二醇（北京市化学试剂三厂）；偶氮二异（AIBN，天津福辰化学试剂厂），使用前
重结晶出去杂质；实验用水为二次蒸馏水。
1.2 毛细管壁预处理
对石英毛细管壁做预处理，主要是引入双官能团试剂γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）。γ-MAPS的一端含有烷氧基团，与石英毛细管壁的硅羟基反应，另一端含有双键，在下一步单体聚合时参与聚合反应。毛细管壁预处理的具体步骤如下：利用水泵的负压将0.1mol/L的氢氧化钠、水、丙酮依次通过毛细管；通入氮气，吹干毛细管；将30%的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷/丙酮溶液充满处理后的毛细管，密封过夜；用丙酮冲洗毛细管，氮气吹干，备用。乙炔站设计规范
1.3 聚合物整体固定相的制备
将单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（0.90mL）、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(0.30mL)和三元致孔剂（正丙醇1.05mL、1，4-丁二醇0.60mL、水0.15mL）溶液混合后，加入12mgAIBN，超声震荡5min，使其充分溶解，然后通氮气除氧3min。溶解后，立即将反应混合溶液注入经双官能团试剂处理过的毛细管中，并用硅橡胶将两端密封，放入60ºC恒温水浴中连续加热24小时，通过热引发在柱管中原位聚合得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱。反应完成后，将整体柱连接在高压液相谱泵上，用乙醇和水冲洗毛细管，去除致孔剂、未反应单体及其它可溶性化合物。
配制50mL 2mol/L的Na2CO3缓冲液，加入5g亚胺基乙二酸和2g NaCl，超声震荡使其充分溶解，然后用NaOH调节pH至11。利用水泵负压将该溶液以10μL/min流速循环流过甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱，保持70℃恒温反应12 h。反应完成后，用水冲洗毛细管，再用0.1mol/L的NaOH溶液以0.05ml/min流速冲洗整体柱，整体柱上即引入羧酸基阳离子交换基团。
2. 结果与讨论
2.1 毛细管内壁予处理
虽有文献报道[3]可在未处理的毛细管中制备整体固定相，并在连续床层未与毛细管内壁键合的情况下直接进行谱实验。我们对比了石英毛细管内壁经过预处理和未经预处理的整体柱的稳定性。结果显示，在相同流速和柱压下，未经预处理的整体柱的连续床层发生移动，整体柱基质被冲出管外；经过预处理的整体柱则表现出良好的稳定性。因此本实验中毛细管均做了预处理。
2.2 温度对聚合物孔结构的影响
实验结果表明，随着聚合温度的升高，整体柱材料的最大孔径变小。首先，温度影响引发剂的分解速度，反应温度越高，引发剂形成的自由基数目越多，形成的核的数目也越多，使得每个核的尺寸减小，而大孔材料是由相互交联的小球组成的，所以小球的尺寸决定了小球间空隙的尺寸。其次，高温下形成的小孔聚合物质紧密，能够承受较高的压力。
2.3 致孔剂组成对聚合物孔结构的影响
随着致孔剂/单体的比值增加，整体柱的渗透性增加。致孔剂通过在反应的早期影响聚合物链在反应溶液中的溶解度来控制整体柱的孔隙性质。
致孔剂经常是由多种有机溶剂组成的。当致孔剂中作为聚合物良溶剂（本实验中的正丙醇）的溶剂的含量降低，由于聚合物在良溶剂中溶解度较高，因而形成的“核”的数量也更少，所得聚合物微球粒径增加，聚合过程中相分离发生较早，孔径也相对增大。
2.4 交联剂含量对聚合物孔结构的影响
实验结果表明，交联剂含量增加，孔径变小。交联剂含量增加，其与单体之间的聚合度相应增加，在聚合初期出现高度交联的聚合物，从混合溶液中析出，使得相分离提前。增加交联剂含量会使得核的交联度增加，并且会影响核随单体膨胀，因此最终形成的核较小。先形成的小球与后形成的核之间虽然仍有吸附作用，但不会发生共聚，形成的多孔结构由较小的“簇”组成，因此孔径较小。
2.5 离子交换基团的导入与柱性能评价
通过实验优化确定弱阳离子交换整体柱的最佳改性条件为：改性温度75ºC，改性时间24h，改性pH值为12。实验表明：制备的多根整体柱之间的重复性以及同一整体柱多次进样时的重复性都很好。
利用前沿谱分析法研究了溶菌酶溶液浓度、流速及缓冲盐溶液浓度等因素对分离时间、突破曲线形态等谱性能的影响，实验结果显示制备的弱阳离子交换整体柱具有优异的动力学传质特性，而且能够在高流速、低样品消耗量的条件下实现蛋白质的快速分离。 2.6 蛋白质的分离
在生物大分子的离子交换谱分析分离中，控制流动相的pH值非常重要。流动相pH 的变化不但会改变蛋白质的净电荷，还会影响配体的电离程度，从而影响蛋白质在离子交换谱上的保留。使用离子交换谱分离蛋白质时，通常流动相的pH高于或低于pI一个单位。实验表明，流动相pH值偏离pI越多，蛋白质的保留值就越大。
本文采用10mmol/L Na2HPO4-HCl缓冲体系，pH控制在6。在长度为1.5cm长的弱阳离子交换毛细管整体柱上快速分离了三种蛋白质，谱图如图1所示。
1.4 聚合物整体柱的离子交换基团修饰
图1 蛋白质在弱阳离子交换整体柱上的分离
柱长5cm，内径0.32mm； 流动相：A= 10mM Na2HPO4-HCl(pH=6)，B= A+1 M CH3COONa (pH=6)；
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流速：0.1mL/min；梯度洗脱：0∼2min，0% B；2∼2.1min，0∼5% B；2.1∼3.1min，5% B；3.1∼3.2min，5∼20%B；3.2∼4.2min，20% B；柱压：160bar；进样量：1μL；UV检测波长：280nm。谱峰依次为：粗卵蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶。
一条伏尔加的鱼
参考文献：
[1] Yuji U, Tomonari U, Jinxiang L, Tamao O, Kin-ichi T. Anal. Chem. 2004, 76: 7007
[2] Zakaria P, Hutchinson J P, Avdalovic N, Liu Y, Haddad P R, Anal. Chem. 2005, 77: 417医疗纠纷论文
[3] Perers E C, Petro M, Svec F, Fréchet J M J. Anal. Chem.,1998, 70:2296
离子谱方法发展和复杂样品分析中的几个问题
牟世芬
(中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京,100085)
摘要：本文通过实际样品的分析，讨论分离方式和检测方式的选择、分离度的改善和样品前处理。
一、分离方式和检测方式的选择
离子谱有三种主要的分离方式和三种检测方式，数十种分离柱，在作一个未知样品或方法发展时，首先考虑的是选择适当的分离和检测方式.分析者对待测样品应有一些一般信息，首先应了解待测化合物的分子结构和性质以及待测成分的浓度和样品的基体情况。待测离子的pk值、疏水性和水合能是决定选用何种分离方式的主要因素。水合能高和疏水性弱的离子，如Cl-或K+，可用常规离子交换分离柱分离。水合能低和疏水性强的离子，如高氯酸（ClO4-）或四丁基铵，最好用亲水性强的离子交换分离柱或离子对谱分离。有一定疏水性也有明显水合能的p K a值在1与7之间的离子，如乙酸盐或丙酸盐，最好用离子排斥谱分离。有些离子，既可用阴离子交换分离，也可用阳离子交换分离，如氨基酸，生物碱和过渡金属等。
检测方式选择的一般的规律是：在水溶液中以离子形态存在的离子，其酸式离解常数pka 或碱式离解常数pKb小于5，应选用电导检测。具有对紫外或可见光有吸收基团或经柱后衍生反应后（IC中较少用柱前衍生）生成有吸光基团的化合物，选用光学检测器，具有在外加电压下可发生氧化或还原反应基团的化合物，可选用直流安培或脉冲安培检测。对一些复杂样品，为了一次进样得到较多的信息，可将两种或三种检测器串联使用。若对所要解决的问题有几种方案可选，分析方案的确定主要由基体的类型、选择性、过程的复杂程度以及是否经济来决定。
常见的在水溶液中以离子形态存在的离子，包括无机和有机离子，以弱酸的盐（Na2CO3/NaHCO3, KOH、NaOH）或强酸（H2SO4、甲基磺酸、HNO3、HCl）为流动相，阴离子交换或阳离子交换分离，电导检测，已是成熟的方法，有成熟的谱条件可参照。对近中性的水可溶的有机“大”分子（相对常见的小分子而言），若待测化合物为弱酸，则由于弱酸在强碱性溶液中会以阴离子形态存在形态存在，选用较强的酸，因此选用较强的碱为流动相，阴离子交换分离；若待测化合物为弱碱，则由于在强酸性溶液中会以阳离子作流动相，阳离子交换分离；若待测离子的疏水性较强，由于与固定相之间的吸附作用而使保留时间较长或峰拖尾，则可在流动相中加入适当有机溶剂，减弱吸附，缩短保留时间、改善峰形和选择性。对该类化合物的分离也可选用离子对谱分离，但流动相中一般含有较复杂的离子对试剂。此外，对弱保留离子可选用高容量柱和弱淋洗液以增强保留，对强保留离子则反之。对疏水性和多价离子的分离，可选用亲水性固定相减弱样品离子与固定相之间的疏水作用。
二、分离度的改善
改善分离度的最有效而简单的方法是选用适当的分离柱，例如，NO3-和ClO3-，由于它们的电荷数和离子半径相似，在用碳酸盐作淋洗液的阴离子交换分离柱上共淋洗。但ClO3-的疏水性大于NO3-，在用OH-作淋洗液的亲水性柱上或离子对谱柱上就很容易分开了。
淋洗液种类、浓度和有机溶剂的适当选择，可有效地改善分离度。离子谱 分离是基于淋洗离子和样
品离子之间对树脂有效交换容量的竞争，为了得到最佳的分离，样品离子和淋洗离子应有相近的亲合力。离子谱中由于固定相结构不同，特别是离子交换功能基的选择性和亲水性不同，所用淋洗液亦不同。离子交换功能基为烷基季铵的阴离子交换剂 ，主
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