小鼠Th1Th2的检测方案

小鼠Th1/Th2的检测

检测原理

小鼠Th1/Th2 细胞及Tc1/Tc2 细胞与人的相似，均可分泌多种细胞因子:

Th1 细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β/α等;

Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6 清华同方真爱和IL-10

刺激素选用PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素), Monensin(莫能星)将细胞因子阻止在细胞内高尔基体。

采用CD3 儿茶酚和CD8 反设门法，即CD3+CD8+代表Tc，CD3+CD8-代表Th，在此基础上得到丰子恺画画不要脸>sciIFN-γ和IL-4 表达的百分率。

【试剂】

PMA、 Ionomycin、Monensin 和RPMI1640、固定剂、破膜剂、红细胞裂解液等

CD3、CD8、IFN-γ、IL-4抗体

管号加入的抗体注释

1 空白对照

2 CD3 荧光补偿

3 CD8 荧光补偿

4 IFN-γ 荧光补偿

5 IL-4 荧光补偿

6 CD3 CD8 IFN-γ IL-4 CD3+CD8- IFN-γ+为Th1 细胞

CD3+CD8- IL-4+为Th2 细胞

CD3+CD8+ IFN-γ+为Tc1 细胞

CD3+CD8+ IL-4+为Tc2 细胞

【实验步骤】

1) 全血标本：取90ul 肝素钠（不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠）抗凝全血标本于试管中，用RPMI 1640稀释至600ul；

2) 加入15μl 1μg/mlPMA 工作液 + 12μl 50μg/ml Ionomycin 工作液 + 10.2μl 0.1mg/ml Monensin 工作液，混匀

3) 37℃，5% CO2 培养箱培养4～6 小时。(不能超过6 个小时)

4) 将己处理的全血分成6 管，每管100μl, 编号为1、2、3、鞅不等式4、5、6

5) 按上表加入0.25ug 江苏科技大学学报抗CD3和0.5ug 抗CD8抗体, 室温，避光孵育15 分钟

6) 每管中加入100μl固定液，室温，避光孵育15 分钟

7) 每管中加入3mL PBS，1200 rpm 离心5 分钟，弃除上清。(此时需用剩余的些许PBS 轻轻震荡来重悬细胞，以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)

8) 每管中加入100μl破膜和溶血液，同时按上表加入0.5ug抗IFN-γ、IL-4抗体：

9)室温，避光孵育15 分钟。每管中加入3mL PBS，1200 rpm 离心5 分钟，弃除上清

10)0.5mL PBS 重悬细胞，上机检测

本文发布于:2024-09-22 02:07:42，感谢您对本站的认可！

标签：细胞全血加入分泌标本检测步骤细胞因子

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