材料和方法
东芝m30
一、材料
1 所需主要试剂
GW4064购自invitrogen公司，二甲基亚砜（DMSO）购自美国sigma公司。11995 DMEM培养基\胎牛血清购自美国Gibco BRL公司。进口分装牛血清白蛋白（BSA）购自上海年丰生物技术有限公司。硝酸纤维素膜、Whatman 3MMOL/L滤纸、聚丙烯酰胶浓缩液-29：1、过硫酸铵（APS）、甘氨酸均购于华舜生物工程有限公司。细胞裂解液RIPA及PMSF购自上海申能公司。丽春红染液购自碧云天生物技术公司。Trizol RNA抽提试剂，RNA逆转录酶及Olig dT购自invitrogen 公司。SYBR® Premix Ex Taq TM荧光实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。KOD-Plus-购自日本TOYOBO公司，限制性内切酶及PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、质粒纯化试剂盒（MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 ）均购自TaKaRa公司；pGEM-T Easy Vector SystemI购自Promega公司；质粒测序由上海博尚生物技术有限公司进行；脂质体2000购于Invitrogen公司羊抗人chemerin抗体购自美国R&D公司；荧光素酶报告基因测定试剂盒购自Promega公司。鼠抗人GAPDH抗体购自KangCheng生物科技有限公司。HRP标记抗鼠二抗购自上海普飞生物科技有限公司。生物素偶联蛋白Ladder购自cell signal 公司。HRP标记抗羊二抗购自Santa Cruz 公司。HepG2细胞株购自ATCC(American Type Culture Collection)。BCA 蛋白测定试剂盒和West Pico chemiluminescent发光底物来自美国PIERCE公司。 2 GW4064及实验所需液体的配制
GW4064的配制
乐府古题
GW4064按一定比例溶解于DMSO配成终浓度分别：0.5mM、1mM、2mM、5mM、的储存液放于-20℃避光保存。
10×电泳Buffer
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Tris-base 30.3克
Glycine 144克加去离子水，定容至1000ml
SDS 10克
10×转膜缓冲液
称取30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，临用前稀释为1×，加200ml甲醇
10×TBS（应用液：1×TBS）
氯化钠80克
10×TBS：取Tris－Base 24.2克用850ml ddH2O溶解后，用HCl调PH至
7.6，定容至1000ml
分离胶缓冲液：
1.5M Tris.HCl PH 8.8
称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，HCL调PH至8.8，定容100ml
积层胶缓冲液：
0.5M Tris.HCl PH6.8
称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml
1×TBS：取10×TBS 100ml，稀释至1000ml，临用前加0.1％Tween 20，1000ul。（即所谓TBST）
膜封闭液：含有5%（W/V）脱脂奶粉的TBST 缓冲液。
抗体稀释液所有抗体均用含有5%（W/V）BSA的TBST缓冲液稀释至工作浓度。
3 主要仪器设备：
CO2培养箱：美国Thermo公司
超净工作台：苏州净化设备厂
DNA热循环仪：德国Eppendorf公司
蛋白质电泳和转移系统：美国Bio-Rad公司
台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司
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电子分析天平：德国Heraeus公司
台式超声细胞破碎仪：英国SANYO MSE公司
台式离心机（Beckman)
紫外分光光度计（Eppendorf，德国）
DU800紫外/可见光分光光度计（Beckman-Coulter，美国）
低温离心机（Eppendorf，德国）
连续波长扫描酶标仪（TECAN，瑞士）
酶标仪（BIO-RAD，美国）
小型垂直电泳槽（Bio-Rad Laboratories，美国）里约欢迎你
PVDF膜电转移器（BIO-RAD，美国）
凝胶成像系统（Gene Genius Bioimaging System，美国）
ABI 7300荧光定量PCR仪（Real-Time PCR仪）（ABI，美国）LightCycler ® 480荧光定量PCR仪（Real-Time PCR仪）（ROCHE，德国）MilliQ超纯水器（Millipore，美国）
台式多用恒温振荡器（ThermoForma，美国）
pH计（pH211型）（HANNA，意大利）
磁力搅拌器（JENWAY，英国）
恒温箱（Medcenter EinrichtungenGmbH，德国）
杂交炉（UVP，美国）
恒温水浴箱（北京市长风仪器仪表公司，中国）
组织匀浆器（ART MICR，美国）
超低温冰箱（ThermoForma, 美国）
液氮罐（中国）
制冰机（ICEMAN，意大利）
高压灭菌锅（TSAO HSIN，台湾）
精密天平（Sartorius，德国）
欧阳智微
组织包埋机（Leica，德国）
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石蜡切片机AO 820（AO，美国）
摊片机Leica HI1210（Leica，德国)
解剖显微镜（Olympus, 日本）
显微镜Leica DMLB（Leica，德国）
显微摄影系统（Leica DFC320， Leica Microsystems，Cambridge，英国）
恒温水浴摇床（哈尔滨东联电子公司，中国）
载玻片、盖玻片（上海玻璃制品公司，中国）
正置荧光显微镜Nicon ECLIPSE 80i (Nicon，日本)
透射电镜Philip CM120 （Philip，荷兰）
二、方法
1 细胞培养
HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培液在37℃、5％CO2的培养箱中培养，2天换培养液一次。待细胞达80％一90％融合后按1：3比例用含用含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)的胰酶消化传代培养。等到培养板上的细胞长满后用0.2%BSA的DMEM脱血清12小时后即可用于实验。GW4064按一定比例溶解于DMSO配成终浓度分别为：0.5mM、1 mM、2mM、5mM、10mM的储存液，于-20℃避光保存。
2 蛋白质抽提
2.1 用药物处理一定时间的细胞，移去培液，以冰冷的PBS洗3次；
2.2 加入细胞裂解液（具体体积根据细胞数目多少而定），每ml裂解液加10μl
磷酸酶抑制剂（4°C保存）和5μl蛋白酶抑制剂(sigma产品，-20°C保存) 和PMSF（10μg/ml）。必要时用细胞刮。杭州15岁初中生确诊来源查清
2.3 视情况进行超声裂解至液体不再粘稠后，冰上放置30 min；
2.4 用橡皮擦刮下细胞，移至离心管；
2.5 4℃，12000rpm离心15min，转移至另一离心管，吸取上清液，上清液为
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细胞裂解液，（必要时可重复离心，然后吸取上清），即为所抽提的蛋白质。
3 蛋白质定量(BCA法)
3.1 根据试剂盒说明书配制0-2mg/ml标准品；
3.2 配制测定试剂A和B的混合液（A：B为50：1）；
3.3 取96孔酶标仪专用测定板，在待加测定样品的孔中加去离子水22.5 μl，之
后在每孔加入待测样品2.5 μl；
3.4 在设定待加标准品的孔中，分别加入25 μl标准品；
3.5 每孔加入，配好的A和B混合液200 μl；
3.6 用锡箔纸封好酶标板，在酶标仪上用中等强度震荡20秒；
3.7 37℃水浴30分钟；
3.8 将酶标板取出，冷却至室温，分光光度计540nm检测吸光度。按照标准品
的检测结果绘制标准曲线，计算样品浓度。
4 蛋白免疫印迹分析（Western blotting）
三栖人
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
4.1变性蛋白质样本的制备
测定好浓度的各处理组蛋白样本，用裂解液调至同体积同浓度后，加入三分之一体积的4 X loading，混合均匀，放在PCR仪或舒适型孵育仪中，99 ℃变性10分钟后，立即放入0 ℃的冰水浴中冷却，即可上样电泳或置于-20 ℃冰箱储存备用。
4.2 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE电泳分离胶和积层胶（分子克隆，2002）。
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