作者：黎文敏 薛铭 谢利 郭和蓉 张志胜 曾瑞珍
来源：《安徽农业科学》2022年第03期
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摘要 兰花病毒病是制约兰花产业发展的重要因素，其中由建兰花叶病毒（cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（odontolossum ring spot virus，ORSV）引起的病毒病在全球范围内影响广泛且危害严重。目前兰花病毒病尚无特效药可以防治，加强
检疫、及时销毁染病植株以及采用无病毒种苗是病毒病防治的有效措施。因此，对引起兰花病毒病的主要病毒、病毒检测方法和脱毒技术研究进展进行综述，以期为兰花脱毒技术的深入研究和脱毒苗工厂化生产提供参考。 关键词 兰花;CymMV;ORSV;检测方法;脱毒技术
中图分类号 S 436.8 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2022）03-0008-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.002
标贴设计 Research Progress on Technology of Virus Detection and Virus-removing in Orchids
LI Wen-min， XUE Min， XIE Li et al
（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）
Abstract Orchid virus disease is an important factor restricting the development of orchid industry， among which causing by Cymbidium mosaic virus （CymMV） and Od
ontoglossum ring spot virus （ORSV） are widespread and harmful orchid virus diseases in the world. At present， there are no chemical pesticides for effective prevention and control of the diseases， therefore， strengthening quarantine of the viruses， destroying infected plants in time and adopting virus-free seedlings for cultivation are effective prevention and control measures in production. Therefore， focuses on advancements on the kinds of orchid viruses identified， the technologies of detection and virus-removing of the main virus in orchid， in order to provide reference for further studying on virus-removing techniques and production of virus-free seedling in orchid.
Key words Orchid;CymMV;ORSV;Detection method;Virus-removing technology
基金项目 广州市农业农村局项目（19100210，20101396 ）; 广东省现代农业产业技术体系花卉创新团队项目 （2021KJ121 ）;清远市科技计划项目（2021DZX021）;英德市科技计划项目（英科字〔2021〕19号-10）。
作者简介 黎文敏（1997—），女，广西梧州人，硕士研究生，研究方向：花卉遗传育种。通信作者，副研究员，硕士，从事花卉遗传育种研究。
收稿日期 2021-09-28
兰花是兰科植物（Orchidaceae）的总称，约有763个属，28 000种[1]。兰花株型优美、花型独特、花期多样，深受各国人民喜爱，市场前景广阔。近年来，随着国内外贸易和种质资源交换的增加以及兰花种植规模的扩大，兰花病毒病危害日趋严重，对兰花产业发展构成了严重威胁[2]。目前，国内外尚无特效药防治兰花病毒病，加强检疫、及时销毁染病植株和采用无病毒种苗生产是减少病毒病发生和危害的有效措施[3-4]。该研究综述侵染兰花的主要病毒、病毒检测方法和脱毒苗生产技术，对未来脱毒技术的研究和应用进行了讨论，以期为更好开展兰花脱毒苗生产，促进兰花产业发展提供参考。
1 侵染兰花的主要病毒小夜曲托斯蒂
1943年，澳大利亚Magee首次报道了建兰上的一种“黑病”，后被证实为建兰花叶病毒（cymbidium mosaic virus，CymMV）引起的病毒病[5-6]。此后，国内外关于引起兰花病毒病的病毒种类报道逐渐增多。据Lee等[7]统计，全球范围内能侵染兰花的病毒有57种，主要包括齿兰环斑病毒（ORSV）、建兰花叶病毒（CymMV）、辣椒褪绿病毒（capsicum chlorosis virus，CaCV）、黃瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）
、凤仙花坏死斑病毒（impatiens necrotic spot virus，INSV）、兰花斑点病毒（orchid fleck virus，OFV）、落葵皱纹花叶病毒（basella rugose mosaic virus，BaRMV）、菜豆黄花叶病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）等。
建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）是世界范围内对兰花影响广泛、造成经济损失严重的2种兰花病毒[1，8]。建蘭花叶病毒（CymMV）属于马铃薯X病毒属（Potexvirus），病毒颗粒呈线状，能使建兰叶子表面产生褪绿斑点和局部坏死斑、树兰（Epidendrum）产生花叶症，卡特兰（Cattleya）产生局部坏死等[9]。齿兰环斑病毒（ORSV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），病毒颗粒呈直杆状，侵染兰花后的主要症状表现为叶子表面出现黄化条纹或不规则褪绿斑块、坏死斑、黑斑等，黄化部位有时出现凹陷，有些花朵上产生褪斑、花朵畸形等[10]。肖火根等[11]在感病的墨兰（Cymbidium sinense）、文心兰（Oncidium）、大花蕙兰（Cymbidium hybridum）等兰花样品中检出CymMV与ORSV。丁元明等[12]从云南省兰花基地可疑感病兰株中检测出CymMV和INSV复合感染。Sudha 等[13]在万代兰（Vanda）中检测出CymMV、ORSV、番茄斑点枯萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）和Poty virus复合感染。说明多种
病毒可以同时侵染兰花，这种复合感染比单一病毒感染危害更严重，可导致叶片坏死或产生坏死斑，花朵畸形或花瓣碎，植株矮小、黄化或萎蔫等。
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2 兰花病毒检测技术研究进展
病毒检测是兰花脱毒苗生产和病毒病防控的关键环节之一[14]。早期病毒病诊断采用症状观察法[15]，目前在兰花生产依然采用该方法初步判别兰花是否感染病毒，但由于兰花品种多，症状表现影响因素多，有时存在隐症及多重感染等现象，因此该方法较难对侵染病毒进行精确鉴定。为了更快、更准确、更简便地对兰花病毒进行鉴定，研究者开发出多种病毒检测方法（表1），主要包括指示植物法[16]、电镜观察法[17]、血清学检测法[18-20]、分子生物学检测法[21-23]等。采用这些方法可以对CymMV、ORSV、CMV、TMV、BYMV、CaCV、OFV、BaRMV等病毒进行准确检测[16-23]。
指示植物法是将携带有病毒的兰花汁液通过摩擦接种至特定的指示植物上，通过观察寄主植物的病症表现来诊断侵染兰株病毒种类的方法[16]。指示植物检测方法是国内外早期检测兰花病毒的传统方法之一，具有操作简单、成本低的优点，但其对操作环境条件要求严格，检测速度慢，显症时间长，常与其他检测方法配合使用[30]。
电镜检测法通过观察植物病毒颗粒大小、形状、内含体组成和染组织超微结构等方面的特征来鉴定病毒种类的方法[17]。该方法检测速度较快，准确性比指示植物法高，但由于该方法制片过程复杂，仪器设备和人员技术要求高，不适用于大批量检测[17]。近几年，国内在生产中较少使用该方法，国外常与其他检测方法配合使用进行少量样本检测[31-32]。
血清学检测法是利用病毒蛋白与特异性抗体相结合的原理对病毒进行检测的方法[18-20]，主要包括酶联免疫吸附检测法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[33]、快速免疫滤纸测定法（rapid immunofilter paper assay，RIPA）[34]、免疫毛细区带电泳法（immuno-capillary zone electrophoresis，I-CZE）[35]和免疫胶体金技术[36-37]。其中酶联免疫吸附检测法（ELISA）是血清学中应用最广泛的检测方法，为了缩短检测时间、提高检测的准确性和灵敏度，研究者以ELISA为基础开发出了双抗体夹心酶联免疫（DAS-ELISA）[36，38]、斑点酶联免疫（Dot-ELISA）[39]和三抗体夹心酶联免疫（TAS-ELISA）等技术[40]。
分子生物学方法是通过检测病毒核酸来鉴别病毒种类的方法[21-23]，主要包括核酸杂
交技术（nucleic acid hybridization）[41]、分子信标技术（molecular beacons）[42]、反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）[43]、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[44-45]和微阵列芯片检测技术[46-47]等。其中RT-PCR操作简便、检测快速，是分子生物学中应用最广泛的病毒检测方法[48]。
为建立更快速、更简便、特异性和灵敏度更高的兰花病毒检测方法，有研究者分别在电镜技术、血清学和分子生物学等已有的检测方法基础上进行创新，建立了液相谱/质谱联用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）和激光解吸-离子化质谱分析法（matrix-assisted laser desorption-ionization，MALDI）[24]、石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM）免疫传感器[25]、磁还原测定法（magnetoreduction assays，MRA）[26]、光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）[27]、光纤粒子等离子体共振（fiber optic particle plasmon resonance，FOPPR）免疫传感器[28]、微/纳米混合结构免疫-电化学生物传感器（micro/nano hybrid-structured immuno-electrochemical biosensor）[29]等检测新技术，由于这些技术对仪器设备要求高、专业技术性强、迄今并未大量应用于生产实际。
3 兰花脱毒技术研究进展
自Morel[49]于1960年采用茎尖培养进行兰花脱毒苗生产以来，兰花脱毒技术研究取得了明显进展。迄今为止，已开发出茎尖培养脱毒[49-60]、化学处理脱毒[54-55，61-65]、热处理脱毒[54-55，66]、病毒A处理结合花梗组织培养脱毒[67]和超低温处理脱毒[68-70]等技术，建立了卡特兰、文心兰、大花蕙兰、石斛兰、蝴蝶兰、杂交兰、虎雪兰等兰花脱毒苗生产技术体系（表2）。
建兰花叶病毒（CymMV）和齿兰环斑病毒（ORSV）是世界范围内对兰花影响广泛、造成经济损失严重的2种兰花病毒[1，8]。建兰花叶病毒（CymMV）属于马铃薯X病毒属（Potexvirus），病毒颗粒呈线状，能使建兰叶子表面产生褪绿斑点和局部坏死斑、树兰（Epidendrum）产生花叶症，卡特兰（Cattleya）产生局部坏死等[9]。齿兰环斑病毒（ORSV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），病毒颗粒呈直杆状，侵染兰花后的主要症状表现为叶子表面出现黄化条纹或不规则褪绿斑块、坏死斑、黑斑等，黄化部位有时出现凹陷，有些花朵上产生褪斑、花朵畸形等[10]。肖火根等[11]在感病的墨兰（Cymbidium sinense）、文心兰（Oncidium）、大花蕙兰（Cymbidium hybridum）等兰
花样品中检出CymMV与ORSV。丁元明等[12]从云南省兰花基地可疑感病兰株中检测出CymMV和INSV复合感染。Sudha 等[13]在万代兰（Vanda）中检测出CymMV、ORSV、番茄斑点枯萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）和Poty virus复合感染。说明多种病毒可以同时侵染兰花，这种复合感染比单一病毒感染危害更严重，可导致叶片坏死或产生坏死斑，花朵畸形或花瓣碎，植株矮小、黄化或萎蔫等。
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