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张 婷，关贵文，张 婧，鲁凤民，陈香梅
北京大学基础医学院病原生物学系，北京大学感染病研究中心，北京１００１９１ 摘要：目的 探讨肝细胞癌（ＨＣＣ）患者中ＡＵ结合因子１（ＡＵＦ１）对磷脂酰肌醇蛋白聚糖３（ＧＰＣ３）表达的影响及其机制。方法ＴＣＧＡ－ＨＣＣ基因表达数据下载自美国Ｂｅａｄ研究所基因数据分析中心，最终纳入３７１例不同病因的ＨＣＣ组织及５０例癌旁组织；ＬＣＩ－ＨＣＣ基因表达数据下载自ＧＳＥ１４５２０，最终纳入２１４例有随访信息的乙型肝炎相关ＨＣＣ患者。３５例ＨＣＣ及配对癌旁样本选取自２００９年—２０１３年在河南省肿瘤医院接受常规根治性手术的ＨＣＣ患者。采用免疫组化检测ＧＰＣ３和ＡＵＦ１蛋白在ＨＣＣ中的表达及相关性；在ＨＣＣ细胞系中敲减或者过表达ＡＵＦ１后，采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和实时荧光定量ＰＣＲ检测ＧＰＣ３表达；利用ＲＮＡ结合蛋白免疫沉淀实验和ＲＮＡ稳定性检测研究ＡＵＦ１调控ＧＰＣ３表达的机制。计量资料两组间比较采用ｔ检验，计数资料两组间比较采用χ２检验，Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ方法应用于术后患者的生存分析，并使用ｌｏｇ－ｒａｎｋ检验进行生存率的比较。结果 在ＴＣＧＡ和ＬＣＩ数据库中，肝癌组织ＧＰＣ３的表达均显著高于癌旁组织（Ｐ值均＜０．０５）；ＴＣＧ Ａ数据库中，ＧＰＣ３高表达与肝癌患者的不良预后有关（Ｐ＜０ ０５）。免疫组化结果显示，ＧＰＣ３和ＡＵＦ１蛋白均在肝癌组织中呈高表达，阳性表达率分别为７７．１％（２７／３５）和７４．３％（２６／３５）。体外实验结果表明，在肝癌细胞系ＨｅｐＧ２和Ｈｕｈ－７中敲减ＡＵＦ１明显降低了ＧＰＣ３表达（Ｐ值均＜０．０５），而过表达ＡＵＦ１则上调ＧＰＣ３表达（Ｐ＜０．０５）。ＡＵＦ１蛋白可与ＧＰＣ３ｍＲＮＡ结合，敲减ＡＵＦ１导致ＧＰＣ３ｍＲＮＡ稳定性降低。结论 ＡＵＦ１是调控ＧＰＣ３
基因转录后修饰的重要调节因子，ＡＵＦ１和ＧＰＣ３蛋白的异常高表达可能参与肝癌的发生和发展。
关键词：癌，肝细胞；ＡＵ结合因子１；磷脂酰肌醇蛋白聚糖３
中图分类号：Ｒ７３５．７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－５２５６（２０２１）０５－１１１６－０５
ＥｆｆｅｃｔｏｆＡＵ－ｒｉｃｈｅｌｅｍｅｎｔＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１ｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｇｌｙｐｉｃａｎ３ｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ
ＺＨＡＮＧＴｉｎｇ，ＧＵＡＮＧｕｉｗｅｎ，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ，ＬＵＦｅｎｇｍｉｎ，ＣＨＥ
ＮＸｉａｎｇｍｅｉ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅＣｅｎｔｅｒ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅＣｅｎｔｅｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＡＵ－ｒｉｃｈｅｌｅｍｅｎｔＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１（ＡＵＦ１）ｏｎｇｌｙｐｉｃａｎ３（ＧＰＣ３）ｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌ ｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）ａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＴＣＧＡ－ＨＣＣｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｗｅｒｅｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍＢｒｏａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅＧｅｎｏｍｅＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓＣｅｎｔｅｒ，ａｎｄｆｉｎａｌｌｙ３７１ＨＣＣｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｔｉｏｌｏｇｉｅｓａｎｄ５０ａｄｊａｃｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｉｎｃｌｕｄｅｄ；ＬＣＩ－ＨＣＣｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｗｅｒｅｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍＧＳＥ１４５２０，ａｎｄ２１４ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＨＣＣｗｈｏｈａｄｆｏｌｌｏｗ－ｕｐｄａｔａｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄ．Ａｔｏｔａｌｏｆ３５ｐｒｉｍａｒｙｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒｓａｍｐｌｅｓａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｄｊａｃｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｍ
ｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＨＣＣｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｕｎｄｅｒｗｅｎｔｒａｄｉｃａｌｓｕｒｇｅｒｙｉｎＨｅｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌｆｒｏｍ２００９ｔｏ２０１３．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｐｒｏ ｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＣ３ａｎｄＡＵＦ１ｉｎＨＣＣｔｉｓｓｕｅ；ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔａｎｄｑＲＴ－ＰＣＲｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＣ３ａｆｔｅｒＡＵＦ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｒｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ；ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｎｄＲＮＡｔｕｒｎｏｖｅｒａｓｓａｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓ ｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＡＵＦ１ｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＣ３．Ｔｈｅｔ－ｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄａｔａｂｅ ｔｗｅｅｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄｔｈｅｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｒａｔｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓ；ｔｈｅＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｓｕｒｖｉｖａｌａｎａｌｙｓｉｓａｆｔｅｒｓｕｒｇｅｒｙ，ａｎｄｔｈｅｌｏｇ－ｒａｎｋｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＩｎＴＣＧＡａｎｄＬＣＩｄａｔａｂａｓｅｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＣ３ｉｎＨＣＣｔｉｓｓｕｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎａｄｊａｃｅｎｔｔｉｓｓｕｅ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｉｎＴＣＧＡｄａｔａｂａｓｅ，ｔｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎｏｆＧＰＣ３ｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆＨＣＣｐａｔｉｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５）．ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｏｔｈＧＰＣ３ａｎｄＡＵＦ１ｐｒｏｔｅｉｎｓａｒｅｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＨＣＣｔｉｓｓｕｅ，ｗｉｔｈａｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｏｆ７７．１％（２７／３５）ａｎｄ７４．３％（２６／３５），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＩｎｖｉｔｒｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡＵＦ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＣ３ｉｎＨｅｐＧ２ａｎｄＨｕｈ－７ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅＡＵＦ１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰＣ３（Ｐ＜０．０５）．ＡＵＦ１ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｄｂｉｎｄｔｏＧＰＣ３ｍＲＮＡ，ａｎｄＡＵＦ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＧＰＣ３ｍＲＮＡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＡＵＦ１ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｔｈｅＧＰＣ３ｇｅｎｅ，ａｎｄｔｈｅａｂｎｏｒｍａｌｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＵＦ１ａｎｄＧＰＣ３ｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＣＣ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ；ＡＵ－ＲｉｃｈＥｌｅｍｅｎｔＲＮＡ－ＢｉｎｄｉｎｇＦａｃｔｏｒ１；Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－５２５６．２０２１．０５．０２７
收稿日期：２０２０－１２－２１；修回日期：２０２１－０１－１８
基金项目：北京市自然科学基金面上项目（７１８２０７９）；国家自然科学基金面上项目（８１５７２３６６）
作者简介：张婷（１９８０—），女，主要从事ＨＢＶ相关肝癌的研究
通信作者：陈香梅，ｘｍ＿ｃｈｅｎ６１７６＠ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 肝细胞癌（ＨＣＣ）是全球常见的恶性肿瘤之一，位列癌症相关死亡率的第四位［１－２］。尽管最近在ＨＣＣ临床
方面取得了很多进展，但其效果仍然欠佳，ＨＣＣ术后５年生存率只有１５％［３］。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖３（ＧＰＣ３）是一种硫酸肝素蛋白聚糖，位于细胞膜表面，在细胞增殖和分化中发挥重要作
用［４－５］。研究［６－７］表明，ＧＰＣ３在ＨＣＣ中呈异常高表达，且具有很强的肿瘤特异性，被认为是ＨＣＣ关键驱动分子。此外，ＧＰＣ３表达水平与ＨＣＣ的发生发展及预后密切相关，可作为ＨＣＣ的诊断标志物和靶点［４，８－９］。但ＧＰＣ３在ＨＣＣ中异常表达的机制尚未完全阐明。
腺苷酸－尿嘧啶富集元件（ＡＵ－ｒｉｃｈｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＡＲＥｓ）位于ｍＲＮＡ的３′ＵＴＲ区，是最具特征的ｍＲＮＡ降解顺式作用因子。ＡＲＥｓ可被ＡＲＥ结合蛋白识别并结合，进而调控ｍＲＮＡ的稳定性及翻译［１０－１１］。ＡＵ结合因子１（ＡＵ－ｒｉｃｈｅｌｅｍｅｎｔＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１，ＡＵＦ１）也称异质核糖核蛋白
Ｄ（ｈｎＲＮＰＤ），是第一个被鉴定出的ＡＲＥ结合蛋白［１２－１３］。大量研究［１４－１５］表明，ＡＵＦ１高亲和力结合富含ＡＲＥｓ元件
海洋幼虫
的ｍＲＮＡ并调控其稳定性。本研究中，首次发现ＧＰＣ３ｍＲＮＡ的３′ＵＴＲ区含有ＡＲＥｓ序列，ＡＵＦ１可结合ＧＰＣ３ｍＲＮＡ，增强其稳定性，从而上调ＨＣＣ中ＧＰＣ３的表达。１ 材料与方法
１．１ ＴＣＧＡ、ＬＣＩ数据库 ＴＣＧＡ－ＨＣＣ基因表达数据下载自美国Ｂｅａｄ研究所基因数据分析中心（ｈｔｔｐ：／／ｇｄａｃ．
ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ）。采用ＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅ
ｍｉｌｌｉｏｎ）法对ＴＣＧＡ转录组测序数据进行标准化，最终纳入３７１例不同病因的ＨＣＣ组织及５０例癌旁组织。
ＬＣＩ－ＨＣＣ基因表达数据下载自ＧＳＥ１４５２０（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ），最终纳入２１４例有随访信息的乙型肝炎相关ＨＣＣ患者。
１．２ 临床标本 ３５例ＨＣＣ及配对癌旁样本选取自２００９年—２０１３年在河南省肿瘤医院接受常规根治性手术的
ＨＣＣ患者。所有患者均经病理诊断确诊，且均未在手术前接受任何化学疗法或放射疗法。
１．３ 肝癌细胞系 ＨｅｐＧ２细胞购自美国ＡＴＣＣ细胞库，Ｈｕｈ－７细胞购自中国科学院上海细胞库。使用含有
１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青霉素、链霉素的ＤＭＥＭ培养基于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养，待细胞融合度达约
８０％时，用０．２５％胰蛋白酶进行消化传代，取生长至对数期的细胞用于实验研究。
１．４ 主要材料与试剂 ｓｉＲＮＡ购自广州锐博生物；ｐｃｄｈ－
ＡＵＦ１质粒为本实验室构建保存；细胞ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；转染试剂Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＲＮＡｉＭＡＸＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００、Ｔｒｉｚｏｌ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ磁珠及蛋白定量试剂购自美国Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）试剂购自美国Ｒｏｃｈｅ公司；ＲＮＡ合成抑制剂Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｉｎＤ和兔抗ＡＵＦ１抗体购自Ａｂｃａｍ公司；鼠抗人ＧＰＣ３抗体和鼠抗人Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。
１．５ 免疫组化实验 将石蜡块切成５ｍｍ的切片，并用苏木精和曙红染。使用ＡＵＦ１和ＧＰＣ３抗体染并通过ＤＡＫＯＥｎＶｉｓｉｏｎ显系统检测，采用ＡｐｅｒｉｏＳｃａｎＳｃｏｐｅ
ＧＬ虚拟扫描成像系统，并用Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ软件进行分析。根据染强度和对应的阳性细胞
百分比对染切片进行评分［１５］：０分，阴性，０％；１分，弱阳性，＜２５％；２分，适中，２５％～５０％；３～４分，强阳性，＞５０％。
１．６ 细胞转染实验 转染前１天进行细胞传代并细胞计数，按照４×１０５个／孔将细胞接种于６孔板中。按照
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＲＮＡｉＭＡＸ的说明书，将ｓｉＡＵＦ１与对照
ｓｉＮＣ转染至ＨｅｐＧ２与Ｈｕｈ－７细胞中。ＡＵＦ１外源表达质粒和空载对照按照ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００说明书进行转
染。转染６ｈ后，更换新鲜培养基继续培养，并于转染４８ｈ后收集细胞，用于后续实验研究。
１．７ Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ实验 收集细胞沉淀，加入ＲＩＰＡ裂解液进行细胞裂解，ＢＣＡ试剂测定蛋白浓度。ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳分离蛋白，转移至ＰＶＤＦ膜，５％脱脂奶粉室温封闭，一抗４℃孵育过夜。二抗室温孵育１ｈ。用美国
ＬＩ－ＣＯＲ公司Ｏｄｙｓｓｅｙ双红外激光成像系统采集图像，使用Ｔｕｂｕｌｉｎ作为内参。
１．８ 细胞ＲＮＡ提取和ｑＲＴ－ＰＣＲ 按照Ｔｒｉｚｏｌ试剂说明书提取细胞总ＲＮＡ，用Ｎａｎｏ－Ｄｒｏｐ２０００测定ＲＮＡ浓度。
以１μｇ总ＲＮＡ为模板，用随机引物逆转录合成ｃＤＮＡ链。取１μｌ逆转录产物，用ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ法进行ｑＲＴ－
ＰＣＲ。以管家基因Ｃ－ＴＢＰ１作为内参，采用２－△△ＣＴ方法对目的基因的相对表达进行分析，实验所用引物序列如
下。ＧＰＣ３：Ｆ５′－ＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣ－３′，Ｒ５′－ＴＣＴ ＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣ－３′；ＡＵＦ１：Ｆ５′－ＧＡＴＣＡＡＧＧＧＧＴＴＴＴ ＧＧＣＴＴＴ－３′，Ｒ５′－ＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＴＣＴＡ－３′；Ｃ－ＴＢＰ１：Ｆ５′－ＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＡＣ－３′，Ｒ５′－ＣＴＧ ＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＴＣＣ－３′。
１．９ ＲＮＡ结合蛋白免疫沉淀实验 取１×１０７细胞加入３５０μｌＲＩＰ裂解液进行细胞裂解。将ＡＵＦ１抗体或同型
ＩｇＧ对照与ＰｒｏｔｅｉｎＡ磁珠孵育２ｈ，洗去未结合的抗体后加入细胞裂解液上清，４℃孵育过夜。依次加入蛋白酶Ｋ
和ＤＮａｓｅＩ，消化蛋白和ＤＮＡ。使用苯酚氯仿提取和乙醇沉淀分离出共沉淀的ＲＮＡ，用ｑＲＴ－ＰＣＲ法定量检测ＧＰＣ３表达。
１．１０ ＲＮＡ半衰期检测 将ｓｉＡＵＦ１与对照ｓｉＮＣ转染
ＨｅｐＧ２与Ｈｕｈ－７细胞，４８ｈ后，向细胞培养基中加入放线菌素Ｄ（５ｍｇ／ｍｌ）抑制新的ＲＮＡ合成。在加药处理后
０、２、４、６ｈ，收集细胞并提取ＲＮＡ，ｑＲＴ－ＰＣＲ法检测ＧＰＣ３表达。
１．１１ 伦理学审查 本研究经北京大学医学部伦理委员会的批准，批号：ＩＲＢ００００１０５２－１２０８８，并已获得所有患
者的知情同意。
１．１２ 统计学方法 采用ＳＰＳＳ２４．０和ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５
软件进行统计学分析。计量资料两组间比较采用ｔ检验，计数资料两组间比较采用χ２检验。采用Ｋａｐｌａｎ－
Ｍｅｉｅｒ法进行生存分析，并使用ｌｏｇ－ｒａｎｋ检验进行生存率的比较。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ ＧＰＣ３和ＡＵＦ１ｍＲＮＡ在开放数据库ＨＣＣ中的表达及相关性 ＧＰＣ３ｍＲＮＡ在ＨＣＣ组织中的表达水平显著
高于癌旁组织（Ｐ值均＜０．０５）（图１）。在ＴＣＧＡ－ＨＣＣ数据库中，ＧＰＣ３ｍＲＮＡ高表达的ＨＣＣ患者５年总体生存率显著低于ＧＰＣ３ｍＲＮＡ低表达患者（Ｐ＜０．０５）；在ＬＣＩ数据库中，ＧＰＣ３ｍＲＮＡ表达对与乙型肝炎相关ＨＣＣ患者的预后无关（图２）。ＡＵＦ１ｍＲＮＡ在ＨＣＣ组织中的表达水平明显高于癌旁组织（Ｐ值均＜０．０５）（图３）。
图１ ＴＣＧＡ、ＬＣＡ数据库中ＧＰＣ３ｍＲＮＡ的表达水平图２ ＴＣＧＡ、ＬＣＩ数据库中ＧＰＣ３表达水平与ＨＣＣ患者预后的关系
图３ ＴＣＧＡ、ＬＣＩ数据库中ＡＵＦ１ｍＲＮＡ的表达水平
２．２ ＧＰＣ３与ＡＵＦ１蛋白在ＨＣＣ组织中呈高表达 采用免疫组化方法检测了３５例ＨＣＣ样本中ＧＰＣ３和ＡＵＦ１蛋
白的表达水平。结果显示，ＧＰＣ３在ＨＣＣ组织中高表达，大部分ＨＣＣ细胞的胞膜和胞质中均可检测到ＧＰＣ３，其中２０例为强阳性染（≥３分）、７例为中度阳性染（２分）、８例染较弱或呈阴性（＜２分）。而在非肿瘤肝组织中几乎检测不到ＧＰＣ３表达（图４）。ＡＵＦ１也在ＨＣＣ组织中呈高表达，显示出较强的胞核着，其中１６例为强阳性染（≥３分）、１０例为中度阳性染（２分）、９例染较弱或呈阴性（＜２分）（图４）。飞行交响乐
进一步分析显示，ＧＰＣ３和ＡＵＦ１蛋白均在ＨＣＣ组织中呈高表达，阳性表达率分别为７７．１％（２７／３５）和７４ ３％（２６／３５）。６５．７％（２３／３５）的ＨＣＣ组织中ＧＰＣ３和ＡＵＦ１均呈高表达。在２７例ＧＰＣ３阳性组中，２３例（２３／
２７，８５．２％，）ＡＵＦ１染呈阳性，显著高于ＧＰＣ３阴性组中ＡＵＦ１阳性表达率（３／８，３７．５％）（χ２＝７．３５，Ｐ＜
０ ０５），提示ＨＣＣ中ＡＵＦ１可能调控ＧＰＣ３的表达。
２．３ ＡＵＦ１上调ＧＰＣ３的表达 为了明确ＧＰＣ３的表达是否受ＡＵＦ１蛋白调控，在ＨＣＣ细胞系中检测了ＡＵＦ１
图４ ＧＰＣ３与ＡＵＦ１在ＨＣＣ及癌旁组织中免疫组化染结果
敲减及过表达对ＧＰＣ３表达的影响。结果表明，敲减ＡＵＦ１显著下调了ＨｅｐＧ２和Ｈｕｈ－７中的ＧＰＣ３蛋白和ｍＲＮＡ水平（图５ａ）。相反，在Ｈｕｈ－７细胞中过表达ＡＵＦ１则上调了ＧＰＣ３蛋白和ｍＲＮＡ水平（图５ｂ）。
注：ａ，敲减ＡＵＦ１后，ＧＰＣ３蛋白和ｍＲＮＡ水平；ｂ，过表达ＡＵＦ１
出租车资源配置后，ＧＰＣ３蛋白和ｍＲＮＡ水平。
图５ ＨＣＣ细胞系中ＡＵＦ１对ＧＰＣ３表达的影响２．４ ＡＵＦ１结合并稳定ＧＰＣ３ｍＲＮＡ 通过分析ＧＰＣ３ｍＲＮＡ的３′ＵＴＲ区发现，该区域富含尿嘧啶，具有典型的
ＡＲＥｓ序列（图６ａ）。ＲＮＡ结合蛋白免疫沉淀实验结果表明，ＨｅｐＧ２和Ｈｕｈ－７细胞中的ＡＵＦ１蛋白可结合ＧＰＣ３
鼻渊散ｍＲＮＡ（图６ｂ）。在ＨｅｐＧ２和Ｈｕｈ－７细胞中敲减ＡＵＦ１后，ＧＰＣ３ｍＲＮＡ的降解速度明显加快（图６ｃ、ｄ），提示
ＡＵＦ１蛋白可以稳定ＧＰＣ３ｍＲＮＡ。
注：ａ，ＧＰＣ３３′ＵＴＲ区潜在的ＡＵＦ１结合位点示意图；ｂ，ＲＮＡ结合蛋白免疫沉淀实验检
测ＡＵＦ１与ＧＰＣ３ｍＲＮＡ结合；ｃ、ｄ，ＲＮＡ半衰期实验检测ＡＵＦ１敲减对ＧＰＣ３ｍＲＮＡ降解速度的影响。
图６ ＡＵＦ１结合并稳定ＧＰＣ３ｍＲＮＡ３ 讨论
ＧＰＣ３在ＨＣＣ中呈异常高表达，已成为ＨＣＣ的免疫靶标［１６］。既往研究表明，ＧＰＣ３在ＨＣＣ中异常表达
可能与Ｍｙｃ的转录激活［１７］和ＧＰＣ３拷贝数增加［１８］有关，但其具体机制尚未完全阐明。本研究探索了ＲＮＡ结合蛋白ＡＵＦ１对ＧＰＣ３表达的调控作用，发现ＨＣＣ细胞中ＡＵＦ１蛋白可以结合并稳定ＧＰＣ３ｍＲＮＡ，进而上调
ＧＰＣ３表达。本研究首次揭示了ＨＣＣ中ＧＰＣ３异常表达的转录后调控机制，将为研发ＨＣＣ新的靶点提供依据。
ＧＰＣ３是肝脏中的关键肿瘤驱动分子，与ＨＣＣ的发生、发展和预后密切相关。与文献报道结果一致，本研究
发现ＧＰＣ３ｍＲＮＡ水平在ＴＣＧＡ和ＬＣＩ数据库所纳入的ＨＣＣ组织中均显著高于癌旁组织，且在ＴＣＧＡ数据库中ＧＰＣ３高表达的ＨＣＣ患者５年总体生存率更低，提示
ＧＰＣ３高表达与ＨＣＣ患者的不良预后有关。但在ＬＣＩ数据库纳入的乙型肝炎相关ＨＣＣ患者中，未见ＧＰＣ３高表
达与ＨＣＣ患者不良预后有关。近年来基于高通量测序的研究［１９］表明，与非乙型肝炎ＨＣＣ不同，乙型肝炎相关
ＨＣＣ的分子分型以增殖型为主，且其组织学具有更高的侵袭性特征，包括细胞分化程度更低、更多的染体不稳
定及ＴＰ５３突变等，提示乙型肝炎相关ＨＣＣ发生发展中还有其特定的驱动因素。ＧＰＣ３高表达在不同感染背景相关ＨＣＣ中的预后作用不同，可能与乙型肝炎相关ＨＣＣ更复杂的致病机制有关，但需要更深入的研究来确证。
ＡＲＥｓ序列广泛存在于基因的３′ＵＴＲ区，包括编码多种炎症因子、原癌基因、生长因子、细胞周期蛋白的基因。
ＡＲＥｓ序列可以被ＲＮＡ结合蛋白识别，包括ＡＵＦ１、ＨＵＲ、
ＴＴＰ等［１０－１１］。ＡＵＦ１是最早被发现的ＡＲＥ结合蛋白，在包括ＨＣＣ、乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤中表达上
调［１４－１５］。通过数据库分析发现，ＨＣＣ组织中的ＡＵＦ１呈异常高表达，与文献报道一致。采用免疫组化方法进一步证实ＧＰＣ３和ＡＵＦ１蛋白在ＨＣＣ组织中也呈高表达，且二者的表达水平呈正相关。以往研究［１４－１５］多认为ＡＵＦ１与ＡＲＥ结合后，发挥降解靶基因ｍＲＮＡ的作用，并进而抑制基因的表达。但近年有研究［１４］发现，ＡＵＦ１也可以稳定ｍＲＮＡ，并上调基因的表达，如食管癌中
ＡＵＦ１通过稳定ｍＲＮＡ上调ＧＣＨ１蛋白表达。本研究发现，ＧＰＣ３ｍＲＮＡ的３′ＵＴＲ区含有ＡＲＥｓ序列，在ＨＣＣ细
胞中敲减ＡＵＦ１能显著下调ＧＰＣ３的表达水平，而过表达ＡＵＦ１则上调ＧＰＣ３表达。更为重要的是，ＨＣＣ细胞中ＡＵＦ１蛋白能与ＧＰＣ３ｍＲＮＡ结合，敲减ＡＵＦ１后ＧＰＣ３
ｍＲＮＡ的半衰期明显缩短。鉴于ＡＵＦ１蛋白可以结合并稳定ＧＰＣ３ｍＲＮＡ，推测ＧＰＣ３是ＡＵＦ１调控的靶基因之
一，ＨＣＣ中ＡＵＦ１的高表达是导致ＧＰＣ３上调的一个重要机制。
由于ＡＵＦ１是通过蛋白质结合ＧＰＣ３ｍＲＮＡ从而上调其表达水平，是转录后水平调控，因此在ＨＣＣ数据库分析中并没有发现ＡＵＦ１ｍＲＮＡ与ＧＰＣ３ｍＲＮＡ水平间存在显著相关性。此外，
已有文献［１７］报道Ｍｙｃ可转录激活ＧＰＣ３基因的表达，且ＨＣＣ中还存在ＧＰＣ３基因拷贝数增加，提示ＨＣＣ组织中ＧＰＣ３的表达上调包括基因组水平和转录水平的调控。
孤独的普希金
综上，本研究结果表明ＲＮＡ结合蛋白ＡＵＦ１是ＧＰＣ３基因的新调控因子，可在转录后水平上调ＧＰＣ３的表达，
ＡＵＦ１和ＧＰＣ３蛋白的异常高表达可能参与了ＨＣＣ的发生和发展。
利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。作者贡献声明：张婷负责课题的实施与论文撰写；关贵文、张婧负责数据库分析与图表整理；鲁凤民参与修改完善论文；陈香梅负责课题设计，指导撰写文章并最后定稿。
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引证本文：ＺＨＡＮＧＴ，ＧＵＡＮＧＷ，ＺＨＡＮＧＪ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆ
ＡＵ－ｒｉｃｈｅｌｅｍｅｎｔＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ１ｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｇｌｙｐｉ
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（本文编辑：林 姣）
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