论著自噬与NLRP3炎症小体在硬化肝组织部分
白燕南1，2，赖建林1，2，周松强1，2，王耀东1，2（1.福建医科大学省立临床医学院，
福州 350001；2.福建省立医院 肝胆外科，福州 350001）
[摘要]目的探讨自噬信号与NLRP3炎症小体在硬化肝组织肝部分切除术后肝再
生进程中的表达情况及可能的作用，期望能为促进肝硬化术后肝再生提供新思路。方
法 C57BL/6小鼠110只随机分为对照组和实验组，每组55只，通过建立正常肝与硬化 肝-50%及70%肝切除-肝再生模型，观察两组小鼠肝部分切除术后生存率、残肝重量
变化、肝组织形态学变化及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表
达情况，测定小鼠血清谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草转氨酶
（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）及白介素18（interleukin-18，IL-18）、白介素1β
（interleukin-1β，IL-1β）水平，并检测小鼠自噬相关蛋白及炎症小体NLRP3、胱天蛋白酶1
（Caspase1）蛋白的表达情况。结果对照组小鼠术后残肝重量明显高于实验组小鼠，差异
有统计学意义（P=0.02）。对照组术后48h细胞核分裂象最多，PCNA表达最高。实验组
在术前可见较多细胞核分裂象及PCNA阳性细胞核，术后24～48h之间细胞核分裂象较
少，PCNA少量表达，72～120h缓慢逐渐增加。两组小鼠肝部分切除后血清GOT、GPT、
IL-18、IL-1β水平均较术前升高（P<0.05），实验组术后各时点显著高于对照组（P<0.05）。
实验组自噬相关蛋白Beclin1、LC3B术前表达高于对照组，术后24h、48h升高不明显，低
于同时点的对照组自噬水平，而Caspase1、NLRP3表达水平术前、术后均高于对照组。结
论实验组肝部分切除术前及术后早期阶段NLRP3炎症小体均活化，术后活化水平显著高
于对照组，但自噬水平下调，肝再生能力下降，肝再生启动延缓，这种下降可能与NLRP3
炎症小体活化、自噬下调有关，但其具体作用机制有待进一步研究。
[关键词]肝硬化；自噬；NLRP3炎症小体；肝再生
DOI：10.16746/jki.11-9332/r.2020.04.007
A Preliminary Study on Autophagy and NLRP3 Inflammasome in The regeneration
Process of Liver Cirrhosis
Bai Yannan1，2, Lai Jianlin1，2, Zhou Songqiang1，2, Wang Yaodong1，2(1.Shengli Clinical
Medical College of Fujian Medical University, Fuzhou, 350001, Fujian, China; 2.Department of Hepatobiliopancreatic Surgery, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, China)
[Abstract] Objective To explore the expression of autophagy and NLRP3 inflammasome
activation in the liver regeneration, hoping to provide new ideas for promoting liver regeneration of
liver cirrhosis. Methods Models undergoing 50% and 70% hepatectomy was respectively established
to calculate the survival rate and liver weight/body weight ratio, to observe the liver histomorphology
and the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) after hepatectomy, to measure the
serum levels of glutamic-pyruvic transaminase (GPT), glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT),
interleukin-18(IL-18) and interleukin-1β (IL-1β), and to detect the expressions of autophagy,
基因敲除>那一代人的读书功夫NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) and Caspase-1. Results The postoperative liver
weight of mice in the control group was significantly higher than that in the liver cirrhosis group.
The expression of PCNA was the highest in the control group at 48h. In the cirrhosis group, more
基金项目：福建省卫生计生青年科研课题（2014-1-5）；福建省立医院优秀青年课题（2014YNQN072）；福建省医学创新课题（2015-CX-5）；福建省自然科学基金项目（2017J01177）；福建省立医院“创双高”火石基金（2019HSJJ03）
通信作者：白燕南，Email：***************。
mitotic figures and PCNA positive nuclei were seen before surgery, and fewer mitotic figures were seen between 24h and 48h after surgery with PCNA gradually increasing from 72h to 120h. Serum GOT, GPT, IL-18 and IL-1β levels in both groups were significantly higher than those before partial hepatectomy (P< 0.05). Furthermore, these biomarkers at each postoperative timepoints in the cirrh
osis group were significantly higher than those in the normal group (P < 0.05). The expression of autophagy-related proteins in the cirrhosis group were lower than that in the control group after partial hepatectomy, but the expression levels of caspase-1 and NLRP3 were higher in the cirrhosis group than those in the control group preoperatively and postoperatively (P < 0.05).Conclusion The activation of NLRP3 inflammasome was significantly enhanced in the cirrhosis group, while the level of autophagy was down regulated. They may be linked to activation of NLRP3 inflammasome and the decrease of liver regeneration ability, but the specific mechanism needs further research.
[Key words] Liver cirrhosis; Autophagy; NLRP3; Liver regeneration
我国肝癌患者较多，多数患者肝脏具有病毒性肝炎或肝硬化的疾病背景，肝功能储备严重下降。正常肝脏具有强大的再生和增殖能力，而在肝纤维化或肝硬化的疾病背景下，肝脏再生能力有限，常量的肝切除即可能导致显著的肝细胞坏死，继而导致肝衰竭[1-2]。自噬作为真核细胞内高度保守的代谢途径，参与了许多疾病发生发展的病理生理过程。有研究指出自噬在正常肝脏肝再生过程中发挥重要的调控作用[3]，而自噬在硬化肝组织再生进程中的作用机制尚无系统性的理论研究。NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）介导的炎症小体的激活在细胞增殖过程中发挥重要作用。其中，NLRP3的研究较为深入，多种内源性或外源性刺激物均可激活NLRP3炎症小体。适度抑制NLRP3炎症小体的活性可防止正常肝脏肝切除后的炎症损伤，从而促进了肝再生和肝脏功能的恢复[4]。研究报道NLRP3 炎症小体与自噬能够相互调控[4]，而在硬化肝组织再生进程中二者的相关作用关系尚未见报道。本研究拟通过建立肝硬化肝切除动物模型，初步探索肝切除术后肝硬化小鼠肝脏中自噬过程的变化，以及NLRP3炎症小体活化、炎症介质释放的情况，探讨自噬与NLRP3炎症小体在此过程中可能的作用关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂C57BL/6小鼠，雄性，清洁级，由福建医科大学动物实验中心提供。标准鼠食喂养，12h昼夜生活环境。四氯化碳（CCl4）由北京普天同创生物科技有限公司提供，使用前用橄榄油配成体积分数为20％的CCl4油剂溶液；小鼠白介素18（interleukin-18，IL-18）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉博士德生物科技有限公司；谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；组织细胞裂解液购自美国CST公司；Beclin1、LC3B、P62 抗体购自美国Abcam 公司；胱天蛋白酶1（Caspase1）、NLRP3抗体购自美国CST 公司；PCNA抗体购自福州迈新生物技术有限公司；GAPDH抗体购自北京全式金生物技术有限公司。1.2 CCl4诱导肝硬化模型的建立6周龄C57BL/6小鼠110只随机分为对照组和实验组，每组55只。实验组动物按150mg/kg腹腔注射CCl4油剂溶液，每周腹腔注射2次，连续10～12周。对照组小鼠腹腔注射等量等次的橄榄油溶剂。观察2组小鼠一般活动、精
神状况和饮食量。苏木精-伊红染（hematoxylin and eosin staining，HE staining，后称“HE染”）观察实验组小鼠肝脏硬化程度，评价建模是否成功。1.3 小鼠肝部分切除术小鼠手术操作均在SPF级环境中完成。每组取20只小鼠，术前小鼠禁食6h，禁水2h，5%异氟烷吸入麻醉，根据Higgins肝切除法，沿腹部正中线开腹暴露肝脏，游离剪断肝周系膜，3-0细丝线结扎切除小鼠肝脏左外叶和/或中叶，分别建立50%及70%肝切除模型，止血后关闭腹腔。术后常规饲养，观察小鼠的存活情况，记录术后10d的生存率。每组剩余的35只小鼠，在肝切除术（手术按照上述方法进行）后0h、24h、48h、72h、120h、168h、240h分别处死小鼠，测量小鼠残肝重量，获取肝组织标本。同时摘除眼球进行采血，所取血标本置于冰上静置，４℃离心后取血清，－80℃低温保存。每个时间点n=5。
1.4 小鼠肝切除术后肝组织病理形态学观察切取肝切除术后处死小鼠的余肝组织块，置于10％中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片行常规HE染，光学显微镜下观察小鼠肝组织结构变化。
1.5肝再生能力观察指标增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达情况体现肝再生能力，用免疫组织化学法（EnVision 法）进行测定，操作步骤按说明书进行。以磷酸缓
冲液代替一抗为阴性对照。PCNA阳性染定位于细胞核，随机选取5个400倍视野，对每个视野的阳性细胞进行计数，取平均值。PCNA阳性细胞数越多，肝再生能力越强。检测时间点分别为术后0h（可认为是术前肝组织状态）、24h、48h、72h和120h。1.6 小鼠血清GPT、GOT水平的测定按照血
清GPT、GOT检测试剂盒说明书测定小鼠肝切除术后0h（可认为是术前肝组织状态）、24h和48h的血清GPT及GOT水平。
1.7 小鼠血清IL-18、IL-1β水平的测定采用ELISA 法测定小鼠肝切除术后0h（可认为是术前肝组织状态）、24h和48h的血清IL-18、IL-1β水平，参照试剂盒说明书进行操作，酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）450nm处检测各孔的吸光度（A）值，根据标准曲线计算检测样本的浓度。细胞因子的浓度表示为“pg/ml”。
1.8 自噬与NLRP3炎症小体相关指标用蛋白质印迹法（Western Blot）检测自噬相关蛋白（Beclin 1、LC3B、P62和Caspase-1）及NLRP3蛋白表达水平。切取肝切除术后处死小鼠的余肝组织块，采用组织细胞裂解液提取总蛋白，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将凝胶上的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上。用含5％脱脂奶粉的 TBST缓冲液封闭PVDF膜1.5h，加入一抗[Beclin1、LC3B、P62、Caspase1、NLRP3：1∶1000；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）：1∶5000]，于4℃摇床孵育过夜。加入二抗室温孵育2h。将PVDF膜置于增强化学发光试剂（ECL）中反应1～3min，于伯乐ChemiDoc MP多功能成像系统曝光以显示特异的蛋白信号。蛋白表达的灰度值利用 Image-Pro Plus5.0 软件进行分析，蛋白相对表达为目的基因与内参基因的比值，GAPDH 作为内参。
邑国时代
1.9 统计学分析采用SPSS 25统计学软件包进行数据分析，采用Kolmogorov-Smirnov法对计量资料进行正态性分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示。肝切除术后组间各时点参数，包括残肝重量、PCNA阳性细胞数、血清GPT、GOT、IL-1β和IL-18表达水平的比较采用单因素重复测量的方差分析。各时点组间两两比较采用最小显著性差异法（least-significant difference，LSD）检验。计数资料（生存率）用率（%）表示，采用Kaplan-Meier 法绘制小鼠肝切除术后生存时间曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 小鼠肝部分切除术后10d内生存率本研究分别建立了50%及70%肝体积切除的模型（共40只，每组20只），术中无出血、无胆瘘等。术后观察显示实验组小鼠70%肝切除2d的死亡率高达70%，而50%肝切除2d的死亡率仅3%（图1）。对照组小鼠50%及70%肝体积切除2d的死亡率均较低。因此本研究结合文献报道情况[1-2]，同时为降低术后死亡率，保证后续实验顺利开展，采用50％肝硬化肝脏切除模型小鼠（后续研究中每组35只）进行研究。
2.2 肝部分切除后小鼠肝脏再生能力变化对照组小鼠术后肝重重量增加明显高于实验组小鼠（F=9.815，P=0.02，图2），两组小鼠肝切除术后24h、48h、72h、120h、168h、240h时间点t值分别为0.80、5.87、5.22、4.80、7.73和4.88，P值均＜0.05。术前对照组肝脏表面被膜光滑，边缘完整，镜下小鼠肝小叶结构完整，无坏死、肝细胞脂肪变及炎症细胞浸润（图3A）；实验组肝脏表面粗糙，可见少量小结节形成，边缘锐利，质地脆，镜下肝小叶结构破坏，肝细胞坏死，可见较多细胞核
分裂象，中央静脉与汇管区之间纤维组织增生伴炎症细胞浸润，部分区域见假小叶形成（图3D）。对照组术后24h细胞核分裂象少量出现（图3B），48h 细胞核分裂象最多（图3C），免疫组化显示术后48h PCNA表达最高，72～120h逐渐减少（图4）。实验组在术前可见较多PCNA阳性细胞核，提示与CCl4诱导纤维化模型导致肝损伤肝再生有关，肝部分切除术后24～48h之间细胞核分裂象较少（图3E、3F），PCNA少量表达，72h开始少量增加，72～120h缓慢增加。
图1 对照组及实验组小鼠肝部分切除术后生存曲线图生
存
率
（
%
）
术后生存时间（d）
100
80
60
40
20
246810
图2 对照组及实验组小鼠肝部分切除术后残肝重量情况
两组小鼠肝切除术后24h 、48h 、72h 、120h 、168h 、240h 时间点t 值分别为0.80、5.87、5.22、4.80、7.73和4.88，*代表P < 0.05。
图4 对照组及实验组肝再生能力检测
A.肝切除术后0h 、24h 、48h 、72h 和120h 等各时间点小鼠肝细胞PCNA 蛋白表达情况（免疫组化染，×200）；
B.各时间点PCNA 蛋白表达阳性的小鼠肝细胞数比较。
图3 小鼠肝切除术后不同时间点细胞形态（HE 染，×400）
酒店点菜系统
A.对照组小鼠术前（即术后0h ）；
B.对照组小鼠术后24h ；
C.对照组小鼠术后48h ；
D.实验组小鼠术前（即术后0h ）；
E.实验组小鼠术后24h ；
F.实验组小鼠术后48h 。
A B C
E F
D A
B
对照组
每高倍视野P C N A 阳性细胞数
肝切除术后时间
《理财周刊》
实验组
250
210
170
130
90
50
10
0h 24h 48h 72h 120h
2.3 小鼠血清GPT 、GOT 水平 如表1所示，肝切除
后小鼠血清GPT 、GOT 水平迅速升高。对照组于
术后24h 达高峰，48h 下降，但仍较术前水平升高（P <0.05）。实验组血清GPT ，GOT 值术后各时点较术前明显升高，且升高幅度显著大于对照组，差异有统计学意义（P <0.05），术后24h 达高峰，术
后48h 轻微下降。
2.4 小鼠血清IL-18、IL-1β水平 如表2所示，肝切除
后小鼠血清IL-18、IL-1β水平迅速升高。两组均于术后24h 达高峰，48h 下降，但仍较术前水平显著升高（P <0.05）。实验组血清IL-18、IL-1β水平术后各时点高于对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。
表1 两组小鼠肝切除术后不同时间点血清GPT 和GOT 比较（U/L ，x±s ）
组别GPT
GOT T0T24T48T0T24T48对照组22.67±2.52330.67±20.55175.00±8.0023.33±2.52312.67±13.65130±6.56实验组41.33±5.51
1446.33±69.59
1428.33±60.19
44.67±11.06
71岁过芭蕾六级1430.33±67.26
1388.33±73.10
F 值22.71519.779P 值
0.001
0.005
注：GPT 为谷丙转氨酶，GOT 为谷草转氨酶；T0为肝切除术后即刻（0h ），T24和T48分别为肝切除术后24h 和48h ；两组各时间点对比，差异均有统计学意义（T0、T24、T48时点两两比较，t 值分别为4.2，36.41和38.33，P 值均＜0.05）。
表2 两组小鼠肝切除术后不同时间点血清IL-1β和IL-18比较（pg/ml ，x±s ）
组别IL-1β
IL-18T0T24T48T0T24T48对照组9.83±1.25129.00±6.5686.67±7.0918.33±3.51124.00±7.9479.33±2.52实验组9.83±1.04
237.67±8.74190.67±6.66
23.00±2.00
266.67±8.50194.33±7.77
F 值18.25312.375P 值
0.009
0.03
注：IL-1β为白介素1β，IL-18为白介素18；T0为肝切除术后即刻（0h ），T24和T48分别为肝切除术后24h 和48h ；两组各时间点对比，差异均有统计学意义（T0、T24和T48时点两两比较，t 值分别为2.58、27.42和31.49，P 值均＜0.05）。
2.5 小鼠蛋白表达情况（图5） 对照组自噬相关蛋白
Beclin1、LC3B 在肝切除术后逐渐增加，48h 最高；P62蛋白逐渐下降，48h 最低。提示对照组在肝切除术后自噬水平升高。实验组自噬相关蛋白Beclin1、LC3B 术前表达高于对照组，术后24h 、48h
升高不明显，低于同时点的对照组。肝切除术后对照组及实验组Caspase-1、NLRP3水平均升高，24h 最高，48h 略下降，但实验组术前、术后各时点表达水平高于对照组。
3 讨论
我国大部分原发性肝癌患者合并有肝炎、肝硬化等基础肝病，严重削弱了肝脏储备功能，在此基础上进行大范围肝切除将直接降低外科手术的切除
图5 对照组与实验组小鼠不同时点自噬相关蛋白表达情况
实验组
对照组
Beclin 1
LC3B
P62NLRP3
Caspase-1GAPDH
0h 24h 48h 0h 24h 48h
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