刘娟;郑唯强
【摘 要】目的 分析雄激素受体(androgen receptor,AR)、S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein2,SKP2)在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中的表达及它们与临床病理特征的关系,并对AR、SKP2在TNBC中的表达进行相关性分析.方法 采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC) Envision法检测96例TNBC和35例乳腺腺病/纤维腺瘤中AR、SKP2的表达,采用Western blot法和RT-PCR法分别检测20例TNBC和5例癌旁乳腺组织中AR、SKP2的表达,分析它们与各临床病理特征的关系.结果 IHC结果显示TNBC中AR的阳性表达率较乳腺良性病变低(P＜0.05),SKP2在TNBC中的阳性表达率较乳腺良性病变显著升高(P＜0.05);AR、SKP2在TNBC中的阳性率分别为18.8％、43.8％,AR与淋巴结转移状态显著相关(P＜0.05),无淋巴结转移的肿瘤组AR的阳性表达率较高,AR与年龄、肿瘤直径、组织学级别、神经/脉管受累情况无相关性(P＞0.05),SKP2与组织学级别、神经/脉管受累情况显著相关(P＜0.05),组织学级别较高、神经/脉管受累的肿瘤组SKP2的阳性表达率较高,SKP2与年龄、肿瘤直径、淋巴结转移状态无相关性(P＞0.05).AR、SKP2在TNBC中表达 显著相关(P＜0.05).RT-PCR结果显示在20例TNBC中AR、SKP2的mRNA高水平表达的组织均为8例,其中AR、SKP2共同高水平表达的组织有3例;5例癌旁乳腺组织有3例AR高水平表达,SKP2均低水平表达.同时Western blot法检测显示相似的结果.结论 AR在TNBC中显示较好的预后特征,SKP2在TNBC中显示较差的预后特征,提示它们在TNBC中是否能作为潜在的靶点具有进一步的研究意义.
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2019(048)008
【总页数】8页(P20-26,4)
【关键词】TNBC;AR;SKP2;靶点;预后
【作 者】刘娟;郑唯强
【作者单位】200433上海,海军军医大学附属长海医院病理科;201900 上海市宝山区中西医结合医院病理科;200433上海,海军军医大学附属长海医院病理科
【正文语种】中 文
【中图分类】R73
三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是ER、PR、HER-2均阴性表达的一组乳腺癌亚型，约占浸润性乳腺癌的10%～20%，属于高度异质性肿瘤，具有发病年龄小、侵袭性强、复发率高、临床分期高、组织学级别高等临床病理特征，在完成联合化疗后的前3～5年复发转移风险高，主要为肺、肝、脑等重要器官的转移[1]。由于缺乏受体的表达，内分泌及靶向对TNBC均无明显疗效，相对于其他类型的浸润性乳腺癌，TNBC具有更差的预后，因此成为乳腺癌研究领域的热点和难点。
雄激素受体(androgen receptor，AR)在正常乳腺组织和乳腺癌组织均广泛表达，在ER阳性的乳腺癌，AR阳性表达显示较好的预后；但在ER阴性乳腺癌组，AR表达与预后的关系存在争议。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein2，SKP2)在浸润性乳腺癌中高表达，且与较差的预后相关，但在TNBC中研究甚少。雄激素双氢睾酮和SKP2的结合与增加P27的降解有关，这说明了SKP2与性激素存在一定的关系，但是否与AR表达状态有关还不清楚。基于以上原因，本研究旨在分析TNBC中AR、SKP2表达与不同临床病
理特征的关系，同时对两者进行相关性分析，以期为寻TNBC的新靶点提供理论基础。
材料与方法
webmax1.标本来源：收集笔者医院2010～2015年病理确诊为TNBC并具有完整临床病理资料的石蜡标本96例，同时选取35例乳腺良性病变(乳腺腺病、纤维腺瘤)做为对照。所有病例均重新调阅档案资料，由高年资病理医师复核切片。所有标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片并HE染。在纳入本实验的TNBC样本中，随机选取20例对应的新鲜肿瘤组织及5例距肿瘤组织>5cm的癌旁乳腺组织。所有新鲜标本均在病变组织离体30min内取材，冻存于-80℃冰箱备用。纳入本实验的TNBC具体标准如下：①所有病例都需具有完整的临床病理资料；②所有患者均为初诊手术；③术后病理确诊为TNBC；④术前未行任何内分泌或新辅助化疗。
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2.主要试剂：组织芯片预铸蜡块购于UNITMA公司；鼠抗人单克隆抗体AR(克隆号AR441)购于基因公司，兔抗人单克隆抗体SKP2[克隆号EPR3305(2)]购于英国Abcam公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit(for real-time)反转录试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ
蒋雄达PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。
3.方法：(1)免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)技术是利用抗原抗体特异性结合的原理对组织细胞内的蛋白进行定性、定位或半定量的研究，该技术组织形态学保存完整，蛋白定位直观清晰，在进行形态与功能相结合的研究时具有重要意义；石蜡包埋标本能长期保存，连续切片。因此笔者对96例TNBC及35例良性乳腺病变的石蜡包埋标本采用了IHC法检测AR、SKP2的蛋白表达情况：1)为避免传统石蜡切片进行IHC时出现的费时费力、染结果存在批次时间误差等缺点，本实验将所有纳入的石蜡包埋标本制成组织芯片。根据HE切片选取1～2个典型的肿瘤区域，在原始蜡块上标记相应的打孔位置。构建10×6的微阵列设计图，在原始蜡块的标记位置钻取直径2mm的组织芯1～2 条，严格按照微阵列设计图包埋组织芯。将组织芯片以3μm厚度连续切片，裱于涂胶玻片备用。2)按照IHC中的Envision两步法检测AR、SKP2。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知AR阳性的睾丸组织和Skp2阳性的肾透明细胞癌作阳性对照。(2)Western blot法是对组织细胞内提取的蛋白凝胶电泳处理后，用特异性的抗体检测某特定抗原的一种蛋白质定量检测技术。本实验对20例新鲜TNBC及5例对照癌旁组织采用Western blot法检测组织内AR、SKP2蛋白的表达情况：①取50mg冻存组织剪细后RIPA冰浴下匀浆，低温高速离心后取上清液，B
CA法测定蛋白浓度；②取等量蛋白水煮变性后依次恒压电泳、转膜；③脱脂奶粉封闭，滴加一抗(AR 1∶200； SKP2 1∶1000)、二抗，摇床孵育，ECL显;④暗室曝光，扫描成像。内参为GAPDH。(3)RT-PCR是以mRNA反转录产生的cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增以检测目的基因表达水平的一种分子定量技术。本实验拟采用该技术对20例新鲜TNBC及5例对照癌旁组织检测AR、SKP2的mRNA表达情况：①根据NCBI网站公布人类AR、SKP2基因序列设计引物(表1)，引物由上海轶沤生物科技公司合成；②取50mg冻存组织剪细后相继加入TRIzol、氯仿、异丙醇抽离总RNA，洗涤干燥后溶解RNA并测定浓度；③按照反转录试剂盒说明合成cDNA；④以cDNA为模板根据PCR试剂盒说明进行扩增。所有样本均设3个复孔，结果取3次平均值，每次反应均设空白对照，内参为GAPDH。该实验重复3次。
表1 RT-PCR实验AR、SKP2引物序列基因基因库注册引物序列(5′→3′)上游引物下游引物产物长度(bp)ARNM_000044.4GACATGCGTTTGGAGACTGCGTTTCTTCAGCTTCCGGGCT295SKP2NM_032637.3GGCTGAAGAGCAAAGGGAGTGGCAATCACCCCTTGAGACA281
4.结果判读：(1)免疫组化结果判读：AR、SKP2阳性表达为定位于细胞核的棕黄或棕褐
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信号。采用H-score对染结果进行半定量分析，总分>2分为阳性表达[2]。(2)Western blot法检测结果判读：根据蛋白条带灰度显结果比较样本AR、SKP2的表达。(3)RT-PCR结果判读：根据2-△Ct观察样本AR、SKP2的相对表达。
5.统计学方法：实验结果采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。AR和SKP2的组间比较采用χ2检验，两者相关性分析采用Spearman等级相关分析检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
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结 果
1.AR、SKP2蛋白在TNBC及乳腺良性病变中的表达：96例TNBC组织中AR阳性表达为18例，SKP2阳性表达为42例；35例良性乳腺病变中AR阳性表达为14例，SKP2均阴性表达(图1、图2)。
图1 TNBC癌组织中AR的表达(IHC Envision法，×200)A.阴性表达；B.阳性信号定位于胞质，为阴性表达；C.阳性信号定位于胞核和胞质，为阳性表达；D.AR弱阳性表达；E.AR中等强度表达；F.AR强阳性表达
2.AR、SKP2表达与TNBC不同临床病理因素的相关性：在TNBC中，AR的阳性表达与淋巴结转移状态显著相关(P<0.05)，无淋巴结转移的肿瘤组AR的阳性表达率较高。AR的表达与发病年龄、肿瘤直径、组织学级别以及脉管/神经侵犯状态无显著相关性(P>0.05)。SKP2的阳性表达与组织学级别、神经/脉管侵犯状态显著相关(P<0.05)，组织学级别较高的肿瘤组其SKP2的阳性表达率较高，有神经/脉管受累的肿瘤组SKP2的阳性表达率也较高。SKP2的表达情况与年龄、肿瘤直径、淋巴结转移状态无相关性(P>0.05，表2)。
图2 TNBC癌组织中SKP2的表达(IHC Envision法，×200) A.阴性表达；B.阳性信号定位于胞质，为阴性表达；C.阳性信号定位于胞核和胞质，为阳性表达；D.SKP2弱阳性表达；E.SKP2中等强度表达；F.SKP2强阳性表达
表2 AR、SKP2表达在TNBC中与各组临床病理因素的关系[n(%)]野麻草
临床病理特征nAR表达情况SKP2表达情况阴性阳性χ2P阴性阳性χ2P年龄(岁) <503329(87.9)4(12.1)1.4500.22819(57.6)14(42.4)0.0360.850 ≥506349(77.8)14(22.2)35(55.6)28(44.4)肿瘤直径(cm) <22013(65.0)7(35.0)3.1350.0779(45.0)11(55.0)1.2990.254 ≥27665(85.5)11(14.5)45(59.2)
31(40.8)组织学级别 Ⅰ、Ⅱ3829(76.3)9(23.7)1.0050.31627(71.1)11(28.9)5.6000.018 Ⅲ5849(84.5)9(15.5)27(46.6)31(53.4)淋巴结转移 无4834(70.8)14(29.2)6.8380.00927(56.2)21(43.8)0.0001.000 有4844(91.7)4(8.3)27(56.2)21(43.8)神经/脉管侵犯 无8066(82.5)14(17.5)0.1230.72649(61.3)31(38.8)4.8760.027 有1612(75.0)4(25.0)5(31.2)11(68.8)
3.AR、SKP2在TNBC及良性乳腺病的表达：在35例良性乳腺病变组织中AR的阳性率为40.0%，在96例TNBC组织中AR的阳性率为18.8%，其阳性表达率相对较低(P<0.05)。SKP2在35例良性乳腺病变组织中均阴性表达，在96例TNBC中的阳性率为43.8%，其阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05,表3)。
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