姚嘉明;于芳芳;王小奇;叶蔚;刘彬彬;刘庆生
【摘 要】目的 观察异硫氰酸萘酯(ANIT)诱导的急性肝内胆汁淤积大鼠肝组织法尼醇受体(FXR)的表达的变化及意义.方法 雄性SD大鼠随机分为正常组8只,模型组24只,模型组采用4％ ANIT(麻油配制)100mg/kg一次性灌服诱导大鼠肝内胆汁淤积,于给药后24、48、72h 3个时相点随机处死8只大鼠,正常组以等容量麻油一次性灌胃后48h处死；生化法检测血清TBA水平,荧光定量PCR检测肝组织FXRmRNA的表达,免疫组化法检测FXR蛋白的表达.结果 模型组大鼠血清TBA水平在灌服ANIT 24h后明显升高并达高峰,之后逐渐下降,3个时间点均较正常组明显升高；而肝组织FXRmRNA和蛋白表达在3个时间点均较正常组明显下降,其中24h最低,随时间推移,48、72h逐渐增高；相关性分析发现,大鼠肝组织FXRmRNA表达与血清TBA水平均呈明显的负相关(r=-0.589,P＜0.01).结论 大鼠肝组织FXRmRNA和蛋白表达的下降可能参与ANIT诱导的急性肝内胆汁淤积病理过程.%Objective To investigate the expression of farnesoid X receptor in the liver issue of rats with acute intrahepatic cholestasis and its significance. Methods Male SD rats were randomly divided into 2 groups,with 8 rats in the n
ormal group,24 rats in the model. The model of acute intrahepatic cholestasis in rat was induced by 4% ANIT prepared with sesame oil by gastric gavage. At the ends of 24th,48th and 72th hour after the administration of ANIT,8 rats in model group were respectively randomly sacrificed. The rats in the normal group were administrated with sesame oil by gastric gavage and sacrificed at the 48th hour. The serum TBA level of the rats were detected by full automatic biochemical analyzer. The expression of FXRmRNA in liver were measured by RT - PCR. The protein expression of FXR were detected by immunohistochemistry. Results The serum TBA level was significantly increased in the model group at all three time points. In the 24 hour after administration of ANIT, the serum TBA level was in creased and reaohed the peak time, and then it was decreased. At the same time the protein and mRNA expression of FXR were significantly decreased in the model group at all three time points. The expression of FXRmRNA in liver and the serum TBA level had significantly negative correlation ( r = - 0. 589, P < 0. 01 ) by correlation analysis. Conclusion The decrease of the protein and mRNA expression of FXR in the rats liver may participate in the pathologic process of acute intrahepatic cholestasis induced by ANIT.
【期刊名称】《医学研究杂志》
秦卫刚个人简历【年(卷),期】2012(041)012
列藏本【总页数】3页(P173-175)
【关键词】法尼醇受体;肝内胆汁淤积
【作 者】姚嘉明;于芳芳;王小奇;叶蔚;刘彬彬;刘庆生
【作者单位】310007 杭州市中医院;浙江中医药大学;310007 杭州市中医院;310007 杭州市中医院;310007 杭州市中医院;310007 杭州市中医院
【正文语种】中 文
肝内胆汁淤积是目前临床常见的一种疾病，其发生原因较为复杂，包括遗传性、感染性、药物性、酒精性、自身免疫性、妊娠性和手术后等。该病发生机制尚未完全探明，目前缺乏疗效确切的药物。法尼醇受体(farnesoid X receptor，FXR)又称胆汁酸受体，属于核受体超家族成员。其可通过调控一系列基因的表达，参与胆汁酸的代谢调节，是胆汁酸
合成和转运的关键调节因子。因此，其有望成为肝内胆汁淤积性疾病的药物靶点。本研究使用异硫氰酸萘酯建立大鼠急性肝内胆汁淤积模型。在前期研究中笔者成功地制作了大鼠急性肝内胆汁淤积的模型，大鼠ALT、AST、TBIL、ALP及 TBA 在应用 ANIT 24h后明显升高，于48h达高峰，72h下降，模型组3时相点ALT、AST、TBIL、ALP、TBA 水平均显著高于正常组［1］。本次研究通过对该模型形成过程中大鼠肝组织中FXRmRNA及蛋白表达的变化进行动态观察，分析探讨其特点，为进一步探索肝内胆汁淤积的发病机制提供实验支持。
材料与方法
1．实验动物:SD大鼠32只，雄性，清洁级，体重190～210g，由上海市西普－必凯实验动物有限公司提供，许可证号:SCXK(沪)2008－0016，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，饲养环境通风良好，温度18～22℃，湿度为45% ～65%。玩酷青春下载
2．主要试剂:异硫氰酸萘酯由ACROSORGANICS公司提供，FXR(H－130)兔多克隆抗体为美国Santo Cruz公司产品，Envision两步法免疫组化生物检测试剂盒为美国DAKO公司产品，AxyPrep总RNA小量制备试剂盒为爱思进生物技术有限公司产品，反转录试剂盒、P
erfect Realtime－SYBR Premix EX TaqTM试剂盒均为宝生物工程(大连)有限公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成:大鼠FXR上游引物:5'－GAC CAC GAA GAC CAG ATT GCT －3'，下游引物:5'－TCT CCA CTG CCT CTC TAT CCT T －3'，扩增片段 283bp;大鼠GAPDH上游引物;5'－GAC AAC TTTGGC ATCGTG GA－3'，下游引物:5'－ ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG － 3'，扩增片段133bp。
3．分组及处理:32只SD大鼠随机分成两组，正常组8只，模型组24只。适应性常规喂养1周后，模型组一次灌服用麻油配成4%浓度的异硫氰酸萘酯(ANIT)100mg/kg体重，正常组灌服等容量的麻油;所有大鼠予以标准大鼠饲料喂养，自由饮水。模型组在灌服ANIT后24、48、72h 3个时相点随机处理7～8只，正常组于灌服麻油24h后全部处理。各大鼠于处理前16h禁食不禁水，上午空腹麻醉下取血，分离血清待用;取右叶部分肝组织，以4%多聚甲醛固定，逐级乙醇脱水，常规石蜡包埋待用;其余肝组织投入液氮中冻存，3h后移入－70℃冰箱中保存。其中正常组、模型组24h时相点各有1只大鼠因灌胃时误灌入气管导致窒息死亡。
4．检测方法:血清总胆汁酸(TBA)水平采用全自动生化仪检测。肝组织FXRmRNA表达采用
Real－time PCR法，以RNA制备试剂盒抽提肝组织总RNA，经鉴定无降解、纯度高，紫外分光光度仪测OD260/OD280比值在1．8～2．0之间，根据OD260值计算总RNA浓度。以500ng总RNA为模板进行反转录，反转录反应产物于 20μl反应体积(2×SYBR10μl、10μmol/L 浓度的10μmol/L 上下引物各0．4μl、10ng/μl cDNA模板2μl、ddH2 O补充体积至20μl)中进行PCR扩增，PCR反应条件:预变性95℃ ×3min;95℃ ×5s、60℃ ×45s，共 40 个循环。溶解曲线分析:95℃ ×15s，60℃ ×15s，缓慢上升至95℃×15s。以GAPDH作内参，相对表达量(2－△Ct×102)来表示目的基因mRNA的表达水平(△Ct=目的基因Ct－内参Ct)。肝组织FXR蛋白表达采用免疫组织化学Envision两步法检测，结果判定标准:根据阳性细胞的着程度及着范围进行半定量。阳性强度:不着者为0分，着淡者为1分，中等着为2分，着深者为3分。着细胞阳性范围:无着为0分，着阳性细胞＜1/3为1分，着阳性细胞1/3～1/2为2分，着阳性细胞＞1/2为3分。将每张切片着程度与着细胞阳性范围得分各自相加为其最后计分。
5．统计学方法:采用SPSS 18．0软件包进行统计，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，使用单因素方差分析和非参数秩和检验，相关性分析使用Spearman，P＜0．05为差异有统计学意义。
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结 果
球面滚子轴承1．急性肝内胆汁淤积大鼠各时相点血清TBA 水平的变化:模型组大鼠TBA水平在灌服ANIT 24h后明显升高并达高峰，后开始下降，72h点TBA水平较24h点有明显下降(P＜0．01)。3个时相点均较正常组差异有显著性(P ＜0．01，P ＜0．05，表1)。
表1 急性肝内胆汁淤积大鼠各时相点血清TBA水平的变化(x±s)与正常组比较，＊＊P ＜0．01，*P ＜0．05;与模型组24h比较，ΔP ＜0.01TBA正常组分组 n 21．39 ±11．88模型组 24h 7 466．00 ±32．52＊＊48h 8 422．44 ±34．90＊＊72h 8 136．44 ±74．84*Δ 7
2．急性肝内胆汁淤积大鼠各时相点肝组织FXRmRNA及蛋白表达的变化:模型组大鼠肝组织中FXRmRNA和蛋白表达在24、48及72h 3个时相点均较正常组明显下降(P ＜0．01、P ＜0．05)，其中24h最低，随时间推移，48、72h逐渐增高，而72h点FXRmRNA较24h点表达量明显增高(P＜0．05，表2)。
表2 模型组各时相点大鼠肝组织中FXR蛋白及mRNA的表达(x±s)与正常组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;与模型组24h比较，ΔP ＜0．05蛋白正常组分组 n FXRmRNA FXR 7
8．47 ±3．32 4．50 ±0．58模型组 24h 7 3．11 ±2．11＊＊ 2．36 ±0．56＊＊48h 8 3．54 ±1．65＊＊ 2．63 ±0．74＊＊72h 8 3．96 ±1．91*Δ 2．88 ±0．69＊＊
东邪西毒20113．大鼠肝组织FXRmRNA表达与血清TBA水平的相关性分析:经Spearman检验，大鼠肝组织FXRm-RNA表达与血清TBA水平均呈明显的负相关(r=－0．589，P ＜0．01)。
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