病理学（pathology ）是医学基础科学，也是基础医学和临床医学的重要桥梁科学。病理学的任务就是运用各种技术与方法研究疾病的原因、发生发展过程以及机体的功能、代谢、和形态结构的改变，因而病理学的发展在很大程度上取决于病理技术的进步，特别是近30年来，由于免疫学、细胞生物学、分子遗传学、分子生物学及电子科学的巨大进展，进而新技术、新方法的不断建立，新仪器的不断出现，从而对实验病理学和临床病理学的发展产生了深远的影响。 病理学的发展经历了体液病理学→器官病理学→细胞病理学→超微病理学→分子病理学这五个阶段。自德国病理学家Virchow 发表著名的“细胞病理学说”到140余年后的今天，病理学技术已经有了长足的发展，从尸体剖验、常规石蜡切片HE 染、特殊染等常规组织学技术发展到电子显微镜制样（EM ）、酶组织化学、免疫组织化学（IHC ）、亲和组织化学、细胞培养，再到核酸分子杂交组织化学（HHC ）、原位聚合酶链式反应（原位PCR ）、流式细胞检测、定量组织化学以及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM ）等组织化学技术和相关病理学技术。病理学技术与方法的不断发展和完善使病理学研究在基础研究中逐渐达到了形态与功能、动态与静态、宏观与微观的统一，在临床诊断方面病理诊断被DME （临床科研评估）视为金标准（golden standard ）之一。现就目前常用的病理学技术介绍如下： 供热系数组织学技术 常规病理学技术 化学技术 常规组织化学技术 免疫学技术 酶组织化学技术 分子生物学技术 免疫组织化学技术 细胞生物学技术 杂交组织化学技术 显微设备技术 原位PCR 技术 电子学技术 定量组织化学技术 微波技术 电镜制样技术
1 细胞培养技术 流式细胞检测技术 共聚焦激光扫描技术 显微摄影技术
二、常规病理学技术
常规病理学技术是我们实验室中日常工作的基本方法，也是病理学技术发展的基础。组织需经取材、切成大小适度的小块，放入固定液内固定，使其保持原有生物学状态。固定好再经酒精逐级脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染或特殊染，最后观察。冰冻切片制作需取新鲜组织或将组织迅速存放于液氮，进行前固定或后固定。HE切片一般厚度在4~6μm，光镜分辨率为200nm。在常规技术中，特殊染占有相当大的比重。
三、组织化学技术
组织化学方法的应用极为广泛，特别是应用于科研和临床诊断方面有十分重要的实际价值。组织化学是组织学与化学结合而形成的一门边缘科学，主要研究机体细微结构的化学性质，并在此基础上进一步阐明其生理和病理状态下的改变。1980年组织化学便脱离了生理学趋向于研究组织细胞的结构和化学组成，到1935年为研究正常组织细胞和病理组织细胞中出现的物质变化，更促进了组织化学技术的应用，用组化方法显示组织细胞中的核酸、糖类、蛋白质、脂肪及无机物等物质的存在。随着生物科学的迅速发展，以后又建立了酶组织化学、电镜组织化学、免疫组织化学、亲和组织化学、杂交组织
化学以及定量组织化学。
1953年酶组化只能显示18种酶，到现在可以显示100种以上。二十世纪六十年以来，随着免疫学的发展，又建立了免疫组织化学，到目前为止有上千种组织细胞内的抗原可以得到显示，随着免疫组化各种方法在敏感性、精确性和稳定性方面的不断提高和规范，该项技术目前几乎被各大医院列为常规方法之一。 70年代未到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，特别是质粒和噬菌体DNA载体的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。尤其是非放射性标记探针方法的建立为核酸分子原位杂交（杂交组织化学）的广泛应用奠定了基础。随着近10年计算机科学的发展，人们得到启示，对组织化学结果的传统定性观察方法愈感不能满足科研的需要，因而借助计算机和图像分析仪又建立了定量组织化学技术。
（一）组织化学技术的基本特点
1.组织化学技术的应用范围
（1）研究细胞内及其周围的化学成分，包括定位，定性和定量。
（2）研究化学物质与组织细胞结构的关系。
（3）研究细胞功能改变对其化学物质变化的影响，联系结构、化学成分、机能以阐明组织和细胞的动态变化。
（4）研究病理过程中细胞内及周围环境的生物化学变化及机能形态变化。
2．组织化学技术的基本要求：
（1）保持组织和细胞的固有形态结构。
（2）掌握被测定化学物质的特性，如水溶性、脂溶性、溶解度、特异反应等。
（3）被显示化学物质具有稳定性，反应产物不易降解，有较深的颜沉淀，且稳定不易扩散。
2
4）必须做严格的对照实验，区别假阴性和假阳性反应。
斗齿（二）常规组织化学技术
从1900年至1930年组织化学由主要解释生物的生理现象发展到研究在正常及病理条件下物质的变化，如显核酸（DNA和RNA）、糖类、蛋白质、脂肪等。
（三）酶组织化学技术
酶具有蛋白质的一般物理和化学性质，酶又是一种特殊的蛋白质，它是生物催化剂，可与底物结合并催化底物转变为产物。不同的酶定位于细胞超微结构的不同部位，完成不同功能。酶的上述特点是酶组织化学的理论基础，决定了酶组织化学的基本原理，使组织和细胞内定位酶及其活性检测成为可能。
酶组织化学的主要目的是确定酶在组织和细胞的定位及其生物活性，从而了解组织、细胞和细胞器的生理功能。
（四）免疫组织化学技术
1.免疫荧光组化技术
该技术是抗体（抗原）标记上荧光素（如FITC）与相应的抗原（或抗体）结合，在荧光显微镜下观察组织或细胞中特异抗原或抗体的存在。在病理学研究中，如免疫性疾病多种自身抗体和免疫复合物的显示，组织内抗原物质、肿瘤细胞的抗原变化、肿瘤的病毒等抗原显示都应用了免疫荧光技术。主要由直接法和间接法组成。
2.免疫酶组技术
该技术是利用抗原抗体的特异反应，通过化学方法将酶与抗体相结合，形成酶标记物.。在酶底物的作用下，产生一种在镜下可见的不溶于淀产物，从而显示抗原或抗体。
精神关怀（1）酶标法：1969年由Masson等人建立，由直接法、间接法和酶桥法组成。
（2）PAP法（Peroxidase-Anti-Peroxidase）：又称非标记免疫酶法，1970年由Sternberger 建立，该法具有敏感性高、特异性强、非特异性背景着浅等优点。
（3）ABC法（Avidin-Biotin-Peroxidase Complex)：该法在敏感性、特异性及背景的非特异性着等方面均优于P AP法。
（4）LSAB法或SP法（labelling-strepavidin-biotin-peroxidase）：该法于1990年以后由于链霉亲合素的应用，在敏感性、特异性及背景和非特异性着等方面又优于ABC 法。
（5）EnVison两步法与EPOS一步法：EnVision系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision），把传统的二步、三步分别孵育合为一次孵育。该法具有敏感、省时、方便、背景低避免了内源性生物素干扰等优点。EPOS系统即一抗上已标记过氧化物酶，该法只需一次孵育，具有敏感、省时、即用、背景低避免了内源性生物素干扰等优点。它特别适用于临床免疫病理诊断。
3.免疫金组化技术：
该法既可用于光镜，又可用于电镜，且具有高敏感性和方法简便等特点。
（五）亲和组织化学技术
将一些对某种组织或细胞成份具有高度亲合力的双价或多价结合能力的物质，应用
3
bmw族
到组织化学技术中来，对这些非抗原抗体反应的技术Bayer首次称之为“亲和组织化学”。这些物质包括植物凝集素与糖类、生物素与亲合素和链霉亲合素、SP A蛋白与IgG、激素和维生素与受体、阳离子与阴离子等。由于该法简便，定位性好，目前已在广泛的开展。
（六）杂交组织化学技术
胡延照又称原位杂交（in situ hybridization）。是检出组织、细胞中存在特定或正在表达的基因的方法。本法要在完整地保存目标核酸的同时制备组织切片，并在其上进行杂交。主要包括检测mRNA和DNA两种方法。因此需要组织学技术，分子生物学技术等多种技术的支持。在过去由于原位杂交技术复杂，又需要经验而非常难做，特别是在原位杂交的显阶段因使用放射性同位素标记探针而需要镀膜、自
显影等几个麻频的步骤。自1988年创立了（DIG）标记探针技术以来，使原位杂交技术更为广泛的开展和应用，目前该技术已是各实验室热门的研究方法之一。
四、电镜制样技术
电子显微镜是研究和揭示组织与细胞超微结构中不可缺少的大型精密仪器。现代电子显微镜的分辨率一般可达到0.3nm，有的可达到0.123nm。透射电镜是研究组织或细胞、病毒等的内部微观结构，而扫描电镜所用的冰冻蚀刻技术则是研究组织或细胞的立体结构。将免疫组织化学技术和酶组织化学技术应用于电镜技术便建立了免疫电镜技术和酶电镜技术，使研究手段更为精细和准确。
五、细胞培养技术
大学二手书交易平台细胞培养，又称组织培养，已有100多种的历史，但习惯上常只把1907年以后的偿试和实践才称为“现代组织培养”，而在此之前即作为“萌芽阶段”。
细胞培养是一门涉及面广而又复杂，细致的技术。在从取材、培养到观察、鉴定等一系过程中，它包含有组织学、病理学、生物化学、微生物学、细胞和分子生物学以及遗传学等方面的技术因素。
细胞培养具有以下基本特征：
（1）便于观察各种物理、化学和生物等外界因素对活体组织和细胞的作用。
（2）便于观察和研究细胞结构和功能的动态变化，揭示细胞生命活动的规律。
（3）便于长期观察和研究细胞遗传性状的表达及其变化规律。
（4）能够同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，提高研究结果的客观性。
（5）能作为动物实验和人体试验的桥梁。
（6）在基因工程中，可用于生产某些生物活性物质。
六、免疫化学技术
免疫化学是建立在抗原一抗体特异反应基础上的研究手段。抗原指只进入机体后能诱发机体产生一系列免疫反应，包括产生抗体和形成致敏的免疫细胞，并能与抗体或致敏细胞产生特异性反应的物质。前者称为抗原的免疫原性，后者称为反应原性。抗体是机体在抗原的刺激下所产生的对抗原的特异性球蛋白，又称为免疫球蛋白。
4
免疫化学方法主要包括以下过程：抗原准备→免疫动物→分离抗血清→提取IgG→标记抗体。
七、抗原修复技术
目前，采用甲醛作为常规的组织固定剂，因醛基与蛋白质中的氨基交联使抗原决定簇被掩盖，因而影响免疫组化染结果，这种作用随固定时间增长而加重。一般认为蛋白质抗原决定簇的特异性由氨基酸序列和立体构型决定，当抗原分子受到理化因素（如酶降解、加热、辐射和化学试剂等）的作用时，将导致立体结构的改变，使抗原决定簇的氨基酸序列改变或破坏蛋白质的构象，最终导致抗原决定簇被掩盖或破坏，当再次受到酶、酸或微波金属盐、缓冲液等作用时，使抗原分子的抗原决定簇重排，使抗原性得到不同程度的恢复。该技术包括酶消化、微波辐射和高压等抗原修复方法。
八、定量组织化学技术
又称定量病理学技术，指在定性、定位的形态基础上，利用图象分析仪能较客观而精确地以数字方式表达存在于标本中的各种信息。它依赖于计算机软件和图象处理设备的进步和发展。
（王晓东）
第二章组织标本处理
5
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议