DOIʒ10．13192/j．issn．1000-1719．2014．07．091
c －fos 表达变化的作用机制
朱慧渊
（陕西中医学院，陕西咸阳712046）
摘要：目的：探讨肠易激综合征动物的P 物质（SP ）及c －fos 的表达变化，以及它们在IBS 中的可能作用和临床意义。方法：将SD 大鼠随机分为正常对照组、模型组、疏肝健脾组，给予大鼠反复直结肠灌注中药大黄造成炎症刺激，炎症恢复后予小量电刺激诱发高敏感性的肠道发生应激反应，制备IBS 动物模型，通过免疫组织化学法测定对SP 和c －fos
表达变化及疏肝健脾法对以上指标的调控作用。结果：模型组与正常对照组比较，
SP 、c －fos 阳性表达明显升高（P ＜0.01）；疏肝健脾组与模型组比较，SP 、c －fos 阳性表达减少（P ＜0.01，P ＜0.05）。结论：大黄－电刺激大鼠模型可有效
制备IBS 动物模型；基于“脾主运化”理论的疏肝健脾法能够改善该模型的炎症损伤，对IBS 有一定的防治作用。
关键词：疏肝健脾；肠易激综合征；SP ；c －fos
中图分类号：Ｒ574文献标志码：A 文章编号：1000-
1719（2014）07-1526-03Mechanism of Soothing Liver and Lnving Spleen Therapy on SP and
C －Fos Expression on Ｒats Models with IBS
ZHU Huiyuan
（Shaanxi University of Chinese Medicine ，Xi'an 712046，Shaanxi ，China ）
Abstract ：Objective ：To investigate the mechanism of soothing liver and invigorating spleen on substance P （SP ）and c －fos expression changes on the rats models with IBS．Methods ：SD rats were randomly divided into the blank control group ，model group ，soothing liver and invigorating spleen group．The rat models with IBS were made by perfusing rhubarb repeatedly to cause inflammation．After inflammation recovering ，the rat was stimulated with weak electric curre
nt to induce the supersensitivity from hypersensitive intestine．And then we observed effects of soothing liver and invigorating spleen on the expression of SP and c －fos in colonic mucosal tissue during the stimulation．Ｒesults ：Compared with the blank control group ，the expressions of SP and c －fos in the colonic mucosal of the model group were increased significantly （P ＜0．01）．After the treatment ，the contents in the colonic mucosal were decreased （P ＜0．01，P ＜0．05）．Conclusion ：The rats models with IBS can effectively simulate human irritable bowel syndrome ，and the soothing liver and invigorating spleen can improve prevention and treat the symptoms of the rats models in some degrees．
Key words ：soothing liver and invigorating spleen ；IBS ；SP ；c －fos
陪考老师意外上哈佛收稿日期：2013－12－28
云南省长不识滇基金项目：陕西省科技厅自然基金项目（2012JQ4006）
作者简介：朱慧渊（1979－），女，陕西西安人，副教授，博士，研究方向：
中医药防治胃肠病的实验及临床研究。肠易激综合征（irritable bowel syndrome ，
IBS ）是临床上最常见的功能性肠病，内脏感觉过敏作为IBS 病
理生理特征之一，被认为是IBS 腹部疼痛或不适的机
制，目前认为可能是因为内脏感觉神经通路或神经调
节系统异常有关。近几年研究表明，
IBS 的发病还与心理因素、内脏感觉过敏、胃肠动力紊乱及肠道感染等
多种因素有关［1－2］
。本课题通过观察SP 和c －fos 在
肠易激综合征中的表达变化，探讨肠易激综合征内脏感觉过敏的神经机制，以及疏肝健脾法对其改变调整
的作用机制。
1
材料1.1仪器与设备
台式低速离心机：海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：LX －300；日本OLYMPUS 公司BX20型荧光显微镜摄像机；ZMN －7803型组织包埋机：上海徕卡仪器有限公司；LEICA ＲM2016切片机：上海徕卡仪器有限公司；隔水式恒温培养箱：中国上海精宏医疗设备有限公司，GNP －9080型；5mL 一次性注射器，75%酒精，生理盐水，蒸馏水，试剂瓶，无菌脱脂棉，吸管，载玻片，盖玻片，手术剪，眼科镊，手术镊，手术刀等。1.2主要药品与试剂一抗c －fos （52B83）（美国santa cruz 公司，sc －52746，LOT ：B2807）；一抗SP （武汉博士德，BA0126，LOT ：9F09C ）；免疫组化检测盒（丹麦DAKO 公司二步法EnvisionTM 试剂盒，LOT ：26F1779A ）；大黄注射液（浙江杭州华东医药集团公司，批号：110304179）；痛泻要方（浙江杭州华东医药集团公司，批号：11073165）。1.3实验动物健康Ⅱ级Sprague －Dawley 成年健康大鼠，体重（280ʃ20）g ，均为雄性，在室温为28ħ的
条件下饲养，给予充足清洁饮水、摄食。由浙江大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2007－0005。
2方法
2.1动物模型制备和分组动物随机分为3组：正常对照组、模型组、模型+组（疏肝健脾组）。
正常对照组：给予生理盐水1.0mL只/d灌胃。模型组：给予大黄液2.0mL只/d灌胃，连续7d。停2 d，
然后开始电刺激。将大鼠置于电刺激笼中，通交流电，刺激强度50V，频率2Hz，波宽0.7ms，每刺激3 s，间歇30s，持续刺激15min/d，连续7d。模型+组（疏肝健脾组）：模型制备后，开始。灌服痛泻要方（由四味中药组成）浸膏（2g/kg），每日2次，共3d。
整个过程中避免接触噪声，每天测量体重以调整药量并严密观察大鼠的毛发及精神状况等变化。
2.2指标测定组织标本在中性缓冲福尔马林（pH =7.4）固定12h后，取材脱水，后反复脱水，石蜡在58 60ħ下浸蜡3h，60 62ħ石蜡包埋组织；切片，厚3 4μm，连续切片，捞在载玻片上，60 62ħ烘箱（DHG－9140A型电热恒温箱）烤片2 4h。石蜡切片二甲苯脱蜡、无水乙醇、95%、80%、70%乙醇至水水化；蒸馏水洗；抗原修复：采用高温高压修复（0.01M 柠檬酸缓冲溶液，pH=6.0），时间为120s；蒸馏水洗，
PBS5minˑ3次；3%H
2O
2
PBS溶液阻断内源性过氧
化物酶10min；PBS洗5minˑ3次；滴加一抗，37ħ下孵育60min（c－fos稀释度为1ʒ50，rabbit来源的多克隆抗体；SP稀释度为1ʒ60，rabbit来源的多克隆抗体），用PBS代替一抗为实验空白对照；PBS冲洗，5 minˑ3次；滴加山羊抗兔或小鼠IgG抗体－HＲP多聚体，37ħ孵育40min；PBS冲洗，5minˑ3次；DAB显液显3min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应；Harris苏木素液复染细胞核1min，95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
镜下观察结果：具体的表达采用图像分析系统测量：先在显微镜200倍视野下选择确定3个带染阳性区域并拍照，然后再使用Image－ProPlus5.0图像分析软件对该视野的表达强弱的阳性细胞IOD值进行测量，经平均后代表该标本的染强度，然后进行整理及统计分析。
2.3统计学处理实验数据采用均数ʃ标准差（珋
xʃs）表示，用SPSS软件进行统计学处理，采用t检验，以P＜0.05作为有统计学意义的检测水准。
3结果
3.1疏肝健脾法对大鼠肠黏膜中SP免疫活性表达的影响结果见表1及插页图1。SP免疫反应阳性纤维分布于肠黏膜上皮基部和黏膜固有层，SP染呈较强的棕黄反应，或见散在、点状及簇集分布。模型组中肠黏膜SP表达呈逐渐升高趋势，SP免疫反应阳性纤维增多、增粗，染增强，与模型组比较（P
＜0.01），差异具有极显著性意义；疏肝健脾组SP的阳性强度均值、阳性面积均显著减少，且与模型组比较，呈极显著性差异（P＜0.01）。
夹竹桃教学设计
3.2疏肝健脾法对大鼠脊髓中c－fos免疫活性表达的影响结果见表2、图2。由结果可见，c－fos主要出现在脊髓后角的神经细胞的胞核内，胞浆内少量阳性。典型的c－fos免疫阳性神经元表现为胞核染呈棕褐，胞浆不着，看不出具体的神经元形态。模型组中脊髓中的c－fos表达呈逐渐升高趋势，c－fos 免疫反应阳性染增强，模型组与正常对照组比较（P ＜0.01），差异具有极显著性意义；疏肝健脾组c－fos 阳性强度均值、阳性面积均显著减少，且与模型组比较，呈显著性差异（P＜0.05）。
表1各组SP免疫组化IOD值比较（珋xʃs）
歌王dvd组别n SP
正常对照组8 3.115ʃ0.300模型组8 4.418ʃ0.227*疏肝健脾组8 3.052ʃ0.188★
注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.01。
表2各组c－fos免疫组化IOD值比较（珋xʃs）
组别n c－fos 正常对照组8 2.988ʃ0.205模型组8 4.704ʃ0.359*疏肝健脾组8 3.786ʃ0.294★
注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，★P＜0.05。
4讨论
肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是最常见的慢性功能性疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势，严重危害患者心身健康。临床上多以腹痛、腹部不适、大便频率、性状改变为主，属于功能性疾病。IBS 的病因复杂，主要包括胃肠道动力紊乱及内脏感觉敏感度异常等［3］。IBS的发病机制主要经历了以下几个阶段：运动异常－内脏过敏－神经和肠道相互作用－某些介质参与内脏感觉和过敏［4－5］。可见异物
本课题实验基于以往的研究，制备模型中给予大鼠慢性反复直结肠灌注中药大黄液，造成炎症刺激，后予以小量电刺激，使之处于紧张、焦虑等应激状态，诱发高敏感性的肠道发生应激反应［6－7］。在此模型制备成功后，本课题根据IBS的发病机制，选用疏肝健脾作为基本治法［8］，具体采用痛泻要方进行。该方由白术、白芍、陈皮和防风组成，方中白术燥湿健脾，白芍养血泻肝，陈皮理气醒脾，防风散肝舒脾。四药相配，可以补脾土而泻肝木，调气机以止痛泻。该方为《丹溪心法》所载的名方，其所治痛泻，是由脾虚肝旺、肝气乘脾、升降失常而致，所谓“土虚木贼”之证，适用于IBS的。
本实验采用免疫组化法测定脊髓组织c－fos及肠黏膜组织SP的表达变化，研究疏肝健脾法对此指标的
调控作用，探讨其作用机制。近年来发现一种c－fos基因参与重要脑功能活动的信号转导和调控过程，多种刺激因子，如缺氧、光线刺激、机械刺激、疼痛刺激等均可诱导中枢神经系统（CNS）中c－fos基因的表达［9－10］。结果表明c－fos蛋白的表达量随着刺激强度的增加而增加，c－fos免疫反应阳性染增强，与模型组比较，疏肝健脾组c－fos的阳性强度均值、阳性面
积均显著减少，差别有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，试验组大鼠内脏感觉通路上神经元的高反应性，即c－fos蛋白表达的异常可能在IBS内脏感觉过敏机制中起重要作用。SP是第一个被发现的脑肠肽，可使胃肠蠕动增加、消化道平滑肌收缩增强，并具有刺激小肠、结肠黏膜分泌水和电解质的作用［11］。本研究结果显示，模型组结肠组织中SP含量较正常组显著升高（P＜0.01），疏肝健脾组结肠组织中SP含量较模型组显著降低（P＜0.01），说明疏肝健脾法可调整IBS动物模型体内SP的分泌和释放，从而发挥的作用。参考文献
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西安交通大学学报（医学版），2007，28（5）：506－510．
收稿日期：2014－02－21
基金项目：国家重点基础研究发展计划（“973”计划）课题（2006CB504508）
作者简介：汲广成（1981－），男，山东临沂人，主治医师，博士研究生，研究方向：疼痛的机制研究。
通讯作者：乔晋琳（1963－），男，山西太原人，教授，硕士，研究方向：软组织外科及针刀医学的相关研究，E－mail：jinlin195@163．
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针刀疗法对第三腰椎横突综合征模型大鼠脊髓及DＲG内p38MAPK/CＲEB信号通路的影响
汲广成1，乔晋琳2，李金牛3，周丽君4，郭长青5，王健1，付本升2
（1．辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847；2．海军总医院康复医学科，北京100037；
3．北京中关村医院针灸科，北京100190；4．海军总医院海战伤实验中心，北京100003；
5．北京中医药大学针灸推拿学院，北京100029）
摘要：目的：观察针刀疗法对第三腰椎横突综合征模型大鼠脊髓及DＲG内p－p38MAPK、p－CＲEB的影响。方法：将36只SD大鼠分为正常组、模型组、电针组、针刀组，于造模后对相应组别进行针刀和电针干预。于造模后28d，处死各组大鼠，取腰段脊髓及DＲG，用Western Blot法检测p－p38MAPK、p－CＲEB的变化，并对结果进行统计学分析。结果：针刀组与电针组p－p38MAPK、p－CＲEB表达与模型组比较呈降低趋势。结论：针刀疗法影响第三腰椎横突综合征模型大鼠疼痛的机制可能与p38MAPK/CＲEB信号通路有关。
关键词：针刀疗法；第三腰椎横突综合征；p38MAPK；CＲEB
fda中图分类号：Ｒ245文献标志码：A文章编号：1000-1719（2014）07-1528-02
Effect of Acupotomology on L3Transverse Process SyndromeＲat Spinal Cord
and DＲG about p38MAPK/CＲEB Signal Pathway
JI Guangcheng1，QIAO Jinlin2，LI Jinniu3，ZHOU Lijun4，GUO Changqing5，WANG Jian1，FU Bensheng2（1．Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110847，Liaoniao，China；
2．NAVY Hospital，Beijing100037，China；3．Zhongguancun Hospital，Beijing100190，China；4．School of Acupuncture
and Moxibustion，NAVY Hospital，Beijing100037，China；5．Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100029，China）
Abstract：Objective：To observe the effect of acupotomology on L3transverse process syndrome rat spinal cord and DＲG about p－CＲEB and p－p38MAPK．Methods：Thirty－six SD rats were divided into four groups：normal group，modelg group，EA group
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