网络出版时间：2020-10-99：17网络出版地址：h ttps：///kcms/demO/34.1045.R.202012001520.410.Utml
IL-H调控血管平滑肌细胞TNF-a IL-3JL-3的表达 罗欣，周宏*，顾亚男，李名聪，李昱昊，张胜权
摘要目的初步探讨白细胞介素((6)-1调控血管平滑肌细胞(VSMC)中肿瘤坏死因子a(TNF-A)、I6V、I6D表达及其机制。方法以不同浓度的I6D8(3、14、34、100ny/ml)处理VSMC，采取不同时间，通过Re/kC/e PCR分析TNF a、I6V、、LV mRNA水平的表达;ELISA方法分析TNF a、I6A、I6D蛋白水平表达；用特异性抑制剂分别阻断P38和AKT 信号通路，通过Western blot分析这9条信号途径激活情况及对TNF a、ILA、ILA蛋白表达的影响。结果不同浓度的ILD3能促使VSMC中TNF a、、LA、、LA mRNA水平表达升高，表现出剂量依赖效应;ILD8(30ny/ml)以时间依赖的方式增加3种细胞因子的mRNA及蛋白水平表达。Western 4/结果显示IL-13能够激活p38和AKT；特异性阻断剂分析显示：1LA8调控TNF a、、LA、IL-8的表达部分依赖该9条信号途径的激活。结论ILD8部分依赖y33和AKT信号通路的活化从而促使VSMC中TNF a、ILA、ILV3种炎症因子表达增高。
关键词白细胞介素A3；血管平滑肌细胞；细胞因子；信号转导途径
中图分类号R349.10
文献标志码A文章编号1000-1492(2020)12-1901-05 doi：10.19405/j.c/bl.issnl000-1499.2020.10.41
白细胞介素(intekeubin2))-1是促炎症因子，位于人类基因1号染体，一个24Un的前体，被caspaseT切割成1ku J］。单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞以及皮肤角质形成细胞均能表达16-18o1ku的16-18通过与靶细胞膜上特异性受体结合激活相应的信号途径而发挥作用J］。动脉粥样硬化(athe/scU/sis,AS)是心脑血管疾病的主要原因［］。一般认为脂质代谢障碍是AS的始动因素，其发病机制复杂，最近的研究⑷表明，多种炎症因子在AS发生发展中发挥着重要作用，此外
2729-77-14接收
基金项目国家自然科学基金(编号：31271745)
作者单位：安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室，合肥234732
作者简介：罗欣，女，高级实验师；
张胜权，男，教授，硕士生导师，责任作者,E-m/l:zhany S P-
engquan@ah m u.edu.cu
*对本文具有同等贡献全民公决
也发现AS斑块中16-18的表达水平较高，并且IL-1结合蛋白(P/kpUin18bin/ing p/tein,IL-1BP)能够降低AS斑块形成风险J-4］，提示16-1在动脉硬化发病中可能发挥作用［］。该研究通过探讨16-18对血管平滑肌细胞(voscul/r smooth mus-cie cells,VSMC)炎症因子的表达影响，以期初步阐明ILD8在AS中的作用。
1材料与方法
1.1材料与试剂由生化教研室陈兵老师惠赠的小鼠VSMC，转染了SV44大T抗原(SV44larpe T an/gen)后永生化的VSMC细胞株27只8周龄SPF 级C57BL/6小鼠，体质量22~25y，雌雄不限。小鼠VSMC由该实验室保存。鼠16-18购自美国Pep-/Tech.公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；pp38、pAKT(1:520)和0-actin(1: 1007)抗体购自美国Celt signaling公司；逆转录试剂和RT-PCR试剂均购自日本TAKARA公司；ELISA 试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司; SB223789和LY224772购自美国Sigma公司；引物由上海生工生物工程公司合成。
1.4引物登陆NCBI网站检索甘油酸-3-磷酸脱氢酶(gmceraldedyPe-C-sPospPate dedyp/xenase, GAPDH)、肿瘤坏死因子A(tumor necrosis factor-s, TNF-t)、ILA、16-8基因序列(人，Pk/er Premier5. 2软件设计引物，见表1
表1RT3CR引物序列
基因引物序列53
GAPDH F AGATCATCAGCAATGCCTCCTG
R ATGGCATGGACTGTGGTCATG
ITV F TTGGCAGCCTTCCTGATTTC
R AACTTCTCCACAACCCTCCTG
ITV F TTCGGTCCAGTTGCCTTCT
R GTACTCATCTGGACAGCTC
TNF-t F CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG
R CCTGGTCTGGTAGGAGACG
148方法
1.2.1细胞培养从液氮中复苏鼠VSMC，用含
10%胎牛血清、青霉素(102U/ml)和链霉素(102 mg/mi)的DMEM培养液置于37C2%CO)细胞培养箱培养。当细胞长到77%-89%时，以7x107/ ml的密度接种于24孔细胞培养板。在实验前一天换无血清培养液。
1.0.2Real-9/e PCR检测TNF-a、I LV、16-8的mRNA水平表达在含有VSMC的27孔细胞培养板中分别加入不同浓度的ILD8(3、12、32、102 ny/ml)，继续培养107加入TRIzoi裂解细胞并提取总RNA；在另一块含有VSMC的27孔细胞培养板中分别于不同时间(2、6、12、18、24h)加入I6D8 (34ny/ml)，最后加入TRIzoi裂解细胞并提取总RNA，收取的样本按逆转录试剂盒说明合成cDNA, Real-time PCR扩增分析目的基因表达。PCR反应体系：2X SYBR Premia Ee Tap110pi,ROX DYE I
2.0p i，上下游引物各2.7p i,cDNA2p i,ddH2O 6.8p k总体积20p-o在AB7200荧光定量分析仪上按程序运行，以GAPDH为内参。最后用相对定量分析法分析实验组与对照组。
1.6.0ELI2A法分析TNF-t、ILV、ILV蛋白水平表达在含有VSMC的27孔细胞培养板中分别加入16-18(34ny/ml)，继续培养3d，收集细胞上清液，按ELI2A试剂盒说明书的方法分析VSMC上清液中的16-7s I6V s TNF-t蛋白的表达情况。
1.6.0Wester blot分析I6D8的信号通路在培养有VSMC的27孔细胞培养板中分别采取不同时间(12、32、62、122min)加入16-18(34ny/ml)，用细胞裂解液裂解细胞提取27孔板上总蛋白；在另一块培养
有VSMC的27孔细胞培养板中分别加入SB223789(10p mol/L,p38MAPK抑制剂)和LY294022(52pmol/L,PI3K抑制剂)，lh后再加入16-18(30ny/ml)，继续培养1h，用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。收集的蛋白用12%SDS-丙烯酰胺凝胶为分离胶,12p g蛋白上样，浓缩胶中60V电泳，当蛋白进入分离胶后，102V继续电泳；将蛋白转至PVDF膜上(恒流200mA,U)o5%脱脂牛奶封闭2h，用TBST洗膜3次，每次10min，敷一抗7C过夜，敷二抗2h，用ECL发光剂压胶片发光显影。
1.0统计学处理采用SPSS Stmishcz统计软件进行统计分析，所有计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析。所有数据均来自2次独立的实验。以P<
2.25为差异有统计学意义。2结果
2.1IL-H对VSMC细胞中TNF-a、IL-6、IL-8的mRNA水平表达的影响Real-time PCR检测的结果显示I6D8能促使VSMC中TNF a、ILA、RD的mRNA水平表达量增加，并且与16-1的浓度成正相关，与对照组(2ng/mi)比较差异有统计学意义(P<2.95,F=7&372)；S6D8(34ny/ml)能够促使VSMC中TNF a、ILA、16-8的mRNA水平表达增加，且27U内表达量与时间成正相关，与对照组(2-比较差异有统计学意义(P<7-05,F= 70678)。即TNF a、、LA、16-8的mRNA水平表达量与16-18具有剂量和时间依赖性，见图1
4
3
2
1
TNF-a
IL-6
m il-8
031030
伊格尔顿
6
5
局部地区有血4
3
2
1
IL-8(ng/ml)
#
100
□TNF-a
'盪IL-6
-陋IL-8
612
时间(h)
1824 02
图1Reyl-time PCR检测细胞因子表达
A：ITD3诱导细胞因子表达的剂量依赖性；B：ITD3诱导细胞因子表达的时间依赖性；与7f/ml比较：*P<7.75；与7U比较:#P< 7.95
2.4IL-H对VSMC细胞中TNF-a、IL-6、IL-8的蛋白水平表达的影响ELISA法的结果分析显示I6D8能够显著增加VSMC上清液中TNF-t、ILV、16-8的蛋白水平的表达，且与对照组(2ny/ml)比较差异有统计学意义(P<2.95,F TN fa=77.028,F-=274.265,F c=10&253)，见图2。
2.4IL-H对VSMC细胞中p38MAPK及PI3K AKT信号通路的影响Wester blot的结果分析显示16-1能够增加VSMC细胞中pp38MAPK及yAKT 的水平，其峰值分别在60min及12miu(图3A)
。
IL-18(ng/ml)IL-18(ng/ml)3表达，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P< 0.05,F tnfc=104.46,F-2=22.111,F-= 62.524)；特异性抑制剂LY294002能部分阻断IL-15诱导的TNFc、IL-6、IL-8表达，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.45,F t N fe=24.255-F-=75.382,F t=54.470)，见图4。
A
_□IL-6
-可IL-8
较
图2IL-11增加VSMC细胞中TNF-aJ L-6c
IL-8的蛋白水平表达
'与ITW的蛋白表达；B：TNF-c的蛋白表达；与0ng/ml比
05「P<0.01
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AKT
Actin
图3Western blot分析pp33MAPK及pAKT水平
A：用IT-13(37ng/mi-处理细胞后不同时间点,pp33MAPK及
pAKT水平；B./：Western bls)分析SB、LY处理后pp33MAPK及pAKT水平；SB：SB253530；LY:LY294602
2.3IL-11刺激VSMC后TNF-a、I L-6、IL-6的蛋白的表达水平与p38MAPK及AKT信号通路相关性为了进一步探讨ITD5增加TNF-e、IL-6、IT-5的表达是否与p38MAPK及PTIKAKT信号途径激活激活相关，特异性抑制剂SB223750及LY294002处理VSMC细胞并分析其对IL-15诱导细胞因子表达的影响。图3B、C结果显示，SB203580及LY294002分别特异性部分阻断IL-15激活的P38MAPK及PTK/AKT信号途径。特异性抑制剂SB223780能部分阻断IL-15诱导的TNFc、IL-2.IL-
图4SB223350及LY224002分别特异性阻断IL-11
诱导的TNF-<i、IL-6、IL-8表达
A1B：SB203580部分拮抗IT-13诱导的IL-6、ITW与TNF-c表达；C、D：LY254002部分阻断ITW1诱导的IT-2.IT-C与TNF-c表达；与0ng/mi比较：*P<0.05
3讨论
AS是心脑血管疾病的主要原因。多年来的研究J「7］表明，高胆固醇及高低密度脂蛋白(Uw density/soprotein,LDL)是AS原因之一。目前认为动脉硬化的发病过程：过多的脂质成分沉积在主动脉内膜，氧化或糖化的LDL诱导血管壁细胞产生趋化因子，趋化因子诱导免疫细胞局部聚集，尤其是巨噬细胞。巨噬细胞摄入氧化的LDL形成泡沫细胞进而形成脂质条纹，进一步的脂质沉积和免疫细胞浸润形成AS斑块(包括脂质、泡沫细胞、巨噬细胞和淋巴细胞、⑷。研究证明天然和获得性免疫在AS 的发生发展中都起作用。一系列细胞因子参与了其发展过程。天然免疫和炎症小体活化，尤其是NOD 样受体家族3(NLRP3)和ILD0在AS早期发展中发挥重要作用，胆固醇在动脉硬化斑块沉积活化NLRP3，然后诱导ILD0和IL-15释放5。ILW8和ILD8R a在硬化斑块的细胞中高表达。研究［6-6
］
发现16-18能够进一步刺激其他细胞释放炎症因子，包括I6N y、ILA等，而I6-S8BP能够阻止动脉硬化斑块的形成。本研究显示,3-1体外诱导VSMC 中TNF-t、、LA、GV的表达，提示AS斑块中的细胞因子不仅仅来自免疫细胞,VSMC也表达炎症因子。此外，这些炎症因子还调控内皮细胞及平滑肌细胞的增殖和凋亡，进而参与了AS斑块的发生发展[18]。这一结果说明了I6D8可以通过影响VSMC表达炎症因子产生的次级效应而发挥作用，同时通过阻断I6D8可能成为防治AS的新途径。
进一步的机制研究表明I6D8能够激活VSMC 中p38和PI3K/AKT信号通路，提示I6D8参与了AS中炎症因子激活的信号途径网络并产生协同效应。细胞的信号通路有很多，调控及相互作用极其复杂。研究[/]发现I6D8能够激活y38、ERK1/d MAPKs s STAT3和NFsB等信号途径。此外，研究[5]发现用I6D8处理小鼠皮层神经元发现：ILD8通过增强PRK和磷酸化AKT的水平，激活了PI3IKAKT通路，并进而激活其下游的NFs B o本研究显示16-1激活VSMC细胞的P38和AKT信号通路通路，并进而分析其对炎症因子表达的影响。但是,6-1对VSMC的调控可能还涉及到其他信号通路及调控其他细胞因子的表达、以及对细胞的增殖和凋亡的影响，这些问题均有待进一步研究。
综上，ILD8体外增加VSMC中TNF a、ILA、16-83种炎症因子表达，其机制部分依赖p38和PI3K/AKT信号通路的活化。该结果可能有助于阐明I6D8在AS发生发展中的部分作用机制，为寻AS新的防治措施奠定基础。
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1^1—3X6148reyulatcs tre expression of TNF-a,IL-6,IL-3
in vasedae smootli musc-c cel-s
Luo Xin,Zhou Hong,Gn Y//n,d ai
(Dept of Biocaemistra ani Molecular Biology of A h O u I Medical University,Hefci236736)
Abstract Objective Tv preb/ina/stuby on the regulation of inter/xPin((6)-18in the expression of tumor necrosis factor alpha(TNF-t),16-7,an/16-8in voscul/r smooth musc-e cells(VSMC)mechanism.Methods
网络出版时间：2020-19-52.53网络出版地址:https：///kcms/dxPU34.1065.R.202012021326.417.htmi
杨椋昕、，凤麟飞"，李芳、，刘泽婷、，王元银、
摘要目的探索白藜芦醇(Re：在面神经损伤模型中的作用及机制。方法按照随机分组原则将雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组、和面神经损伤组(Crush组、，对Crush 组大鼠行右侧面神经干夹持损伤建立面神经损伤模型。将Crush组大鼠随机分为3组：对照组(Crush+Ve/iclo组)、白藜芦醇组(Crush+Res
组)以及抑制剂组(Crush+Res+Ax-iCnib组、。采用Wester/blot和QPCR比较不同组大鼠面神经内血管内皮生长因子b(VEGFb)及其受体VEGFR1.VEG-FR0的表达。采用免疫组化对面神经损伤及再生情况进行评估。结果与Crush+VeOhlo组相比，Crush+Res组VEGFb、VEGFR2VEGFR0的表达提高(n=3,P<0.25)，神经再生得到促进。与Crush+Res组相比,Crush+Res+Ax-iCnib组中VEGFb及VEGFR2VEGFR0的表达和神经再生作用被抑制(n=3,P<0.21)o结论Ro在面神经损伤后提高了VEGFb.VEGFR1和VEGFR5的表达，促进神经再生。关键词白藜芦醇；血管内皮生长因子；面神经损伤
谱图中图分类号R745.12
2025-07-22接收
项目基金：国家自然科学基金(编号：3107222)；安徽省科技攻关项目(编号：1406450U)；安徽省重点研究和开发计划项目
(编号：29624307729022)
作者单位/安徽医科大学口腔医学院，合肥230032
5安徽医科大学第一附属医院口腔颌面外科，合肥
237034
作者简介：杨椋昕，女，硕士研究生；
王元银，男，主任医师，教授，博士生导师，责任作者，E
mail：巧01970543@sohu
*对本文具有同等贡献文献标志码A文章编号600-692(2020)6-605-05 doRlO.19405/p cnkS issclOOO-1425.2022.12.417
面神经麻痹是部分或完全丧失面神经功能，主要表现为面部表情肌运动功能障碍，也称为面瘫［］。当面部肌瘫痪时，出现一系列感觉及运动障碍，如鼻唇沟消失，不能上提口角，眼睑不能闭合，不能皱眉，额纹消失等。
白藜芦醇(resveratrol,Ros)是一种天然存在于食物中的多酚化合物，因其在控制氧化应激、炎症和细胞死亡等多个靶点方面的益处而广为人知［］。血管内皮生长因子(vasculoz evkotheliat growth fnc-mz,VEGF)是Ro对神经系统发挥有益作用的靶点之一［］。Heunann et aP4在两项独立研究中发现, Ros提高了受损伤大脑中VEGF的表达水平，从而可能通过此缓解脑损伤。该实验通过构建大鼠面神经损伤模型研究Res对于面神经损伤后的神经再生的作用及VEGF在其作用机制中所扮演的角。
1材料与方法
1.1实验动物36只清洁级成年雄性SD大鼠,5 ~8周龄，体质量150-220g，购自安徽医科大学实验动物中心，常规饲料饲养，自由饮水，温度为22~ 27°C,6h/C2h交替照明。
1-2动物模型建立按随机分组原则将大鼠分为2组，损伤组(Crush组)(1=24)和假手术组(Sham
VSMCs were treated with different concentrations of IL-15(3,6,34,120ng/ml),and nt different Csas ,TNF-a,IL-6,IL-6,TNF-c,IL-6,Expression of IL-8mRNA level;ELIZA method to uiUyze tha protein level expression of TNF-c,IL-6,IL-8；bloch p35and AKT signal pathways with speciCe inkibihrs,and analyaa tha activation of these two signal pathways by Western blot and its eOeci on tha expression of TNF-c ,IL-6and IL-8proteins.Re-sulhi IL-15nt different concentra/ons could increase tha expression of TNF-c,IL-6,IL-8 mRNA in VSMC, showing a dosaEoodot eOect.IT15(30ng/ml)increased mRNA and protein levels of tha three cytodinas in a /sa-2epenqeqt manner.Wasteui blot results showed thnt IL-15can activate p35and AKT；analysis of spacific blocUers found thnt IL-15repulatas tha expression of TNF-c,IL-6,and IL-8in paU doodot on tha activation of p35and AKT signal pathways.Conclusion IL-15paU-y relics on tha qc/vation of p35and AKT signaling pathways to increoso tha expression of TNF-c,IL-6and IL-8in VSMC.
Key wo M s CpUokinW5；vasculoz smooth muscla cells;cymdinas；signal transhucnon pathways
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