ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－７３８６．２０２１．０５．００５
·论著·
曹洪庆 刘广民
作者单位：２７４０００ 山东省菏泽市中医医院普外科
【摘要】 目的 研究ＭＡＰ３Ｋ１４在胰腺癌组织中的表达及对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其分子机制。方法 采用ＲＴ ＰＣＲ法检测胰腺癌组织和正常胰腺组织中ＭＡＰ３Ｋ１４的表达。利用脂质体转染胰腺癌细胞，实验分组：Ｃｏｎ组、ｐｃＤＮＡ３．１组、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ组、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ １７ ５ｐ组。流式细胞术和ＣＣＫ ８法分别检测细胞的凋亡、增殖。采用ＲＴ ＰＣＲ法检测转染后胰腺癌Ｐａｎｃ １细胞中ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达。流式细胞术和ＣＣＫ ８法分别检测细胞的凋亡、增殖。采用双荧光素酶报告基因实验检测ＭＡＰ３Ｋ１４对ｍｉＲ １７ ５ｐ的靶向作用。结果 与人正常胰腺组织比较，胰腺癌组织中ＭＡＰ３Ｋ１４的表达显著降低，ＭＡＰ３Ｋ１４过表达可抑制胰腺癌Ｐａｎｃ １、ＭＩＡＰａＣａ ２细胞的增殖，促进细胞的凋亡。双荧光素酶 报告实验证实ＭＡＰ３Ｋ１４对ｍｉＲ １７ ５ｐ具有靶向作用，ＭＡＰ３Ｋ１４可负向调控ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达。ｍｉＲ １７ ５ｐ过表达可显著逆转ＭＡＰ３Ｋ１４对Ｐａｎｃ １细胞增殖、
凋亡的影响。结论 Ｍ
ＡＰ３Ｋ１４可通过下调ｍｉＲ １７ ５ｐ抑制胰腺癌细胞的增殖、促进细胞凋亡。【关键词】 ＭＡＰ３Ｋ１４；胰腺癌；ｍｉＲ １７ ５ｐ；增殖；凋亡【中图分类号】 Ｒ７３５．９ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １００２－７３８６（２０２１）０５－０６６６－０５ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭＡＰ３Ｋ１４ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ
１７５ｐ ＣＡＯＨｏｎｇｑｉｎｇ，ＬＩＵＧｕａｎｇｍｉｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＴＣＭＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨｅｚｅＣｉｔｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｈｅｚｅ２７４０００，Ｃｈｉｎａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＰ３Ｋ１４ｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｐ
ａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ，ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭＡＰ３Ｋ１４ｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｎｏｒｍａｌｐａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴＰＣＲ．Ｔｈｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｌｉｐｏｓｏｍｅ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕｐ，ｐｃＤＮＡ３．１ｇｒｏｕｐ，ｐｃＤＮＡ３．１ＭＡＰ３Ｋ１４ｇｒｏｕｐ，ｐｃＤＮＡ３．１ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲＮＣｇｒｏｕｐａｎｄｐｃＤＮＡ３．１ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ１７５ｐｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＣＣＫ８ｍｅｔｈｏｄ
，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍｉＲ１７５ｐｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒＰａｎｃ１ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴＰＣＲ．ＴｈｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＡＰ３Ｋ１４ｆｏｒｍｉＲ１７５ｐｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｄｕａｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅａｓｓａｙ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭＡＰ３Ｋ１４ｉｎｐａｎｃｒｅ
ａｔｉｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅｉｎｎｏｒｍａｌｐａｎｃｒｅａｔｉｃｔｉｓｓｕｅ．ＴｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＰ３Ｋ１４ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒＰａｎｃ１ａｎｄＭＩＡＰａＣａ２ｃｅｌｌｓａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｃｅｌｌｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＴｈｅｄｕａｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＭＡＰ３Ｋ１４ｈａｄｔａｒｇｅｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｎｍｉＲ１７５ｐ，ａｎｄＭＡＰ３Ｋ１４ｃａｎｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ１７５ｐ．ＭｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ１７５ｐｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｖｅｒｓｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＭＡＰ３Ｋ１４ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＰａｎｃ１ｃｅｌｌｓ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＭＡＰ３Ｋ１４ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ１７５ｐ．
举宫
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 ＭＡＰ３Ｋ１４；ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ；ｍｉＲ １７ ５ｐ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，胰腺癌的５年生存率为７％～８％，近年来胰腺癌发病率和死亡
率逐年上升［１］
。因此，对于胰腺癌进行早期诊断，采
取积极有效的干预措施阻止胰腺癌的进展是提高患者生存率的关键所在。长链非编码ＲＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｌｎｃＲＮＡ）是长度＞２００个核苷酸的非编码ＲＮＡ，没有编码蛋白的功能。研究发现，ｌｎｃＲＮＡ在调节细胞增殖、凋亡、侵袭及血管生成中发挥着重要功
能［１］
。越来越多的研究表明，ｌｎｃＲＮＡ参与肿瘤细胞的
形成和发展。例如，在肺腺癌、前列腺癌、白血病、结肠
癌和肝癌组织中均发现ｌｎｃＲＮＡ差异表达［２］
。研究发
现，ｌｎｃＲＮＡＭＡＬＡＴ１通过靶向调控ｍｉＲ ２０４表达诱导胰腺癌细胞Ｇ２／Ｍ细胞周期停滞、促进细胞凋亡，抑制
细胞的迁移和侵袭能力［３］。ＬｎｃＲＮＡ ＰＶＴ１通过调节ｍｉＲ ４４８促进胰腺癌细胞的增殖和迁移［４］。ＬｎｃＲＮＡ
ＢＣＡＲ４在胰腺癌细胞中表达升高，ＬｎｃＲＮＡＢＣＡＲ４的
高表达可促进胰腺癌细胞增殖，抑制凋亡［
５］
。有研究报道ｌｎｃＲＮＡＭＡＰ３Ｋ１４在胰腺癌组织中下调表达，其
可能与胰腺癌的发生发展有关［６］
，另外ＭＡＰ３Ｋ１４对
胰腺癌细胞的生物学行为的影响及具体机制尚不清
楚。目前研究已证实丝裂原活化蛋白激酶家族ＭＡＰＫ参与调控肿瘤的发生发展，其中已证明ＭＡＰ
３Ｋ１０可通过上调ｇｌｉ １和ｇｌｉ ２的表达促进胰腺癌细胞增殖［７］，ＭＡＰ３Ｋ１４可抑制乳腺癌细胞生长和侵袭［８］。因此，本研究就ＭＡＰ３Ｋ１４对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响以及是否通过调节ｍｉＲ １７ ５ｐ来影响胰腺癌细胞的增殖凋亡进行研究，以期为今后胰腺癌的提供新的思路。
１ 材料与方法
１．１ 材料 ＲＰＭＩ１６４０培养基购自美国Ｇｉｂｃｏ，胎牛血清购于Ｇｉｂｃｏ，Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒购于ＴａｋａＲＡ，ｌｎｃＲＮＡ提取试剂、荧光定量ＲＴ ＰＣＲ试剂盒购于Ｑｉａｇｅｎ，试剂ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００、ＯＴＩ ＭＥＭ均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。ｍｉＲ ＭＡＰ３Ｋ１４引物合成自上海生工生物公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Ｐｒｏｍｅｇａ，ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ １７ ５ｐ购自武汉淼灵生物科技有限公司，ＣＣＫ ８试剂购自美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司。
１．２ 标本收集 ５５例胰腺癌组织及２５例癌旁组织标本，来源于医院手术的患者，在手术前均未采用放疗和化疗，术后病理诊断是胰腺癌的肿瘤组织和癌旁正常组织的液氮冻存标本。标本的采集均经过患者同意，签属知情同意书，并经过医院伦理委员会审核通过。
１．３ 方法
１．３．１ 细胞培养：采用含有胎牛血清为１０％的ＲＰＭＩ１６４０培养液对Ｐａｎｃ １细胞和ＭＩＡｐａｃａ ２细胞进行培养。使其在温度为３７℃、ＣＯ
２
体积分数为５％的细胞培养箱内培养。定期观察，根据细胞生长状态更换培养液。当细胞铺满瓶底８０％左右时，加入胰蛋白酶消化传代。
１．３．２ 细胞转染及实验分组：收集对数生长期的人胰腺癌Ｐａｎｃ １、ＭＩＡｐａｃａ ２细胞，并以适当密度接种到６孔板上。于细胞培养箱中培养至细胞融合度约为７０％，根据ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００转染试剂使用说明书进行转染，实验分组：Ｃｏｎ组（未进行任何处理的细胞）、ｐｃＤＮＡ３．１组（空载体转染至细胞）、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组（ＭＡＰ３Ｋ１４过表达载体ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４转染至细胞）、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ组（ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４与ｍｉＲ ＮＣ共转染至细胞）、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ １７ ５ｐ组（ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４与ｍｉＲ １７ ５ｐｍｉｍｉｃｓ共转染至细胞），转染６ｈ更换为含有１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基，继续培养４８ｈ后收集细胞。为验证ＭＡＰ３Ｋ１４对ｍｉＲ １７ ５ｐ的靶向调控作用，实
验分组：ｐｃＤＮＡ３．１组、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组、ｓｉ ＮＣ组（ｓｉ ＮＣ转染至细胞）、ｓｉ ＭＡＰ３Ｋ１４组（ＭＡＰ３Ｋ１４小干扰ＲＮＡ转染至细胞）。严格按照ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００转染试剂说明书进行操作。
１．３．３ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ法检测ＲＮＡ的表达：根据Ｔｒｉｚｏｌ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）盒说明书方法抽提各试验组总ＲＮＡ，并测定其浓度。取２ｎｇ总ＲＮＡ加入逆转录试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）转录成ｃＤＮＡ，加８０μｌＤＥＰＣ稀释后，放－２０℃保存。用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＰＣＲ检测试剂盒对５μｌｃＤＮＡ溶液进行荧光定量ＰＣＲ，ＭＡＰ３Ｋ１４引物序列：上游为５’ ＡＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡ ３’，下游为５’ ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣ ３’；内参ＧＡＰＤＨ引物序列：上游为５’ ＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧ ３’，下游为５’ ＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴ ３’；ＰＣＲ反应条件：９５℃２ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，６０℃３０ｓ，７０℃３０ｓ，共４０个循环；解链曲线分析：９５℃１ｍｉｎ，５５℃３０ｓ；然后缓慢升温至９５℃，升温速率为０．２℃／ｓ。采用２ ΔΔＣｔ法分析目的ｌｎｃＲＮＡ的相对表达水平，上述具体操作依试剂盒说明书进行。后续实验中，ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达亦采用ＲＴ ＰＣＲ检测，其中引物分别为ｍｉＲ １７ ５ｐ Ｆ：５′ ＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＴＡＣＡＧＴＧ ３′；ｍｉＲ １７ ５ｐ Ｒ：５′ ＣＣＡＴＡＡＴＧＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣ ３′；Ｕ６作为内参，Ｕ６ Ｆ：５’ ＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＴ ３′；Ｕ６ Ｒ：５′ ＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴＣＡＴ ３′。
１．３．４ ＣＣＫ ８检测细胞增殖：取上述对数生长期的各组Ｐａｎｃ １、ＭＩＡｐａｃａ ２细胞，以每孔２×１０５个密度种植于９６孔细胞板上。培养箱内常规培养，在培养时间截止前２ｈ加入１０μｌＣＫＫ ８溶液，放在５％ＣＯ
２
秸秆、３７℃培养箱中孵育２ｈ，采用酶标仪检测各孔在４９０ｎｍ波长处的吸光度值。
１．３．５ 平板克隆实验检测细胞克隆数：各组细胞培养４８ｈ后用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于细胞培养板中，于３７℃培养箱培养２周，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用ＰＢＳ小心浸洗２次。加４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ，然后去固定液，加适量Ｇｉｅｍｓａ染１０～３０ｍｉｎ，然后用流水缓慢洗去染液，空气干燥。显微镜下计数。１．３．６ 流式细胞术检测细胞的凋亡：转染后４８ｈ的细胞用于实验，消化收集１×１０４个细胞，加入１００μｌＰＢＳ和１００μｌＤＮＡＰｒｅｐＬＰＲ，孵育１０ｍｉｎ后再加１ｍｌＤＮＡＰｒｅｐＳｔａｉｎ，孵育１０ｍｉｎ，流式细胞仪检测细胞周期：收集１×１０５个细胞，ＰＢＳ洗涤后加入５μｌＡｎｎｅｘｉｎ
缓冲液、５μｌ７ＡＡＤ、５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ ＰＥ，避光孵育１０ｍｉｎ后上流式细胞仪分析。
１．３．７ 双荧光素酶报告基因检测实验：采用ｓｔａｒＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｒｂａｓｅ．ｓｙｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／）靶基因预测库检测到ＭＡＰ３Ｋ１４与ｍｉＲ １７ ５ｐ存在结合位点。猜测ｍｉＲ １７ ５ｐ可能是ＭＡＰ３Ｋ１４的一个靶基因。为验证这一猜想，我们构建了野生型ＷＴ ＭＡＰ３Ｋ１４和突变型ＭＵＴ ＭＡＰ３Ｋ１４的荧光素酶报告载体。参照１．３．３中的方法以ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００将ｍｉＲ ＮＣ、ｍｉＲ １７ ５ｐ分别与ＷＴ
ＭＡＰ３Ｋ１４和ＭＵＴ ＭＡＰ３Ｋ１４共转染，于细胞培养箱中常规培养４８ｈ。收集各组细胞，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作步骤进行检测。
１．４ 统计学分析 应用ＳＰＳＳ２２．０统计软件，计量资料以珋ｘ±ｓ表示，２组间采用独立样本ｔ检验，多组间采用单因素方差分析，组间多重比较采用ＳＮＫ ｑ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２ 结果
２．１ ＭＡＰ３Ｋ１４在胰腺癌组织中相对低表达 与人正常胰腺组织比较，胰腺癌组织中ＭＡＰ３Ｋ１４的表达水平明显降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见表１。
表１ ＭＡＰ３Ｋ１４在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达
克顿传媒
ｎ＝３，珋
ｘ±ｓ类别
ＭＡＰ３Ｋ１４正常胰腺组织（ｎ＝２５）１．８９±０．１９胰腺癌组织（ｎ＝５５）
０．５６±０．０５ｔ值４８．６６３Ｐ值
０．０００
２．２ ＭＡＰ３Ｋ１４抑制Ｐａｎｃ １、ＭＩＡＰａＣａ ２细胞增殖并促进细胞凋亡 ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组Ｐａｎｃ １、ＭＩＡｐａｃａ ２细胞中ＭＡＰ３Ｋ１４的表达水平明显高于ｐｃＤＮＡ３．１组（Ｐ＜０．０５），成功构建了ＭＡＰ３Ｋ１４过表达的ｐａｎｃ １、ＭＩＡｐａｃａ ２细胞。转染２４ｈ后，２组细胞的吸光度值差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），而转染４８ｈ和７２ｈ后，ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组的吸光度值较ｐｃＤＮＡ３．１组明显下降（Ｐ＜０．０５）；与ｐｃＤＮＡ３．１组比较，ＭＡＰ３Ｋ１４过表达后Ｐａｎｃ １、ＭＩＡＰａＣａ ２细胞的凋亡数明显增加（
Ｐ＜０．０５），与ｐｃＤＮＡ３．１组比较，ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组Ｐａｎｃ １、ＭＩＡｐａｃａ ２细胞平板克隆数显著降低（
Ｐ＜０．０５）。ＭＡＰ３Ｋ１４过表达可抑制Ｐａｎｃ １、ＭＩＡＰａＣａ ２细胞的增殖、促进
细胞的凋亡。见图１，表２～４
。
图１ 过表达ＭＡＰ３Ｋ１４对细胞Ｐａｎｃ １、ＭＩＡＰａＣａ ２凋亡的影响表２ 过表达ＭＡＰ３Ｋ１４对细胞Ｐａｎｃ １增殖、凋亡的影响
ｎ＝３，珋
ｘ±ｓ 组别ＭＡＰ３Ｋ１４细胞活性（ＯＤ４９０ｎｍ）
２４ｈ４８ｈ７２ｈ凋亡率（％）Ｃｏｎ组０．４９±０．０４０．５０±０．０３０．９８±０．０４１．５３±０．１０７．８２±０．３８ｐｃＤＮＡ３．１组
０．５２±０．０２
０．４８±０．０２
０．９７±０．０４
１．５１±０．１０
７．６６±０．３４
ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组１．４３±０．１０
０．３６±０．０２
０．４７±０．０２
０．６１±０．０４
１９．６９±１．０３
Ｆ值１５．４５６７．３４９１９．３６５１４．４７４１９．２１０
Ｐ值
０．０００
０．００２
０．０００
０．０００
０．０００
注：与ｐｃＤＮＡ３．１组比较， Ｐ＜０．０５
表３ 过表达ＭＡＰ３Ｋ１４对细胞ＭＩＡＰａＣａ ２增殖、凋亡的影响
ｎ＝３，珋
ｘ±ｓ 组别ＭＡＰ３Ｋ１４细胞活性（ＯＤ４９０ｎｍ）
２４ｈ４８ｈ７２ｈ凋亡率（％）Ｃｏｎ组０．５６±０．０２３０．５３±０．０２１．０２±０．０５１．６１±０．１１７．８２±０．２６ｐｃＤＮＡ３．１组
０．５４±０．０２
０．５１±０．０２
０．９９±０．０４
１．５９±０．１１
７．８６±０．２５
ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组１．４６±０．１０
０．４１±０．０２
０．６８±０．０３
０．９７±０．０５
１３．６９±０．５６
Ｆ值２２７．３９５３１．０００６３．７８０４４．６２９２３１．３９８
Ｐ值
０．０００
０．００１
０．０００
０．０００
０．０００
注：与ｐｃＤＮＡ３．１组比较， Ｐ＜０．０５
表４ 过表达ＭＡＰ３Ｋ１４对细胞Ｐａｎｃ １、ＭＩＡＰａＣａ ２平板克隆数的影响
ｎ＝３，珋
ｘ±ｓ 组别平板克隆数
Ｐａｎｃ １ＭＩＡＰａＣａ ２Ｃｏｎ组１１６．１２±１０．２１１１３±１０．３０ｐｃＤＮＡ３．１组
１１４．２１±１０．０５
１０９±１０．０２
ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组５４．０２±５．２３
６０±６．１１
Ｆ值４８．０３１
３２．１５０
Ｐ值
０．００００．０００丁俊发
注：
与ｐｃＤＮＡ３．１组比较， Ｐ＜０．０５２．３ ＭＡＰ４Ｋ１４吸附ｍｉＲ １７ ５ｐ，并负向调控其表达 ｓｔａｒＢａｓｅ软件检测结果，ＭＡＰ４Ｋ１４与ｍｉＲ １７ ５ｐ之间存在互补结合位点。双荧光素酶报告基因实验检测结果，同ｍｉＲ ＮＣ与ＷＴ ＭＡＰ３Ｋ１４共转染比较，ｍｉＲ １７ ５Ｐ与ＷＴ ＭＡＰ３Ｋ１４共转染后，Ｐａｎｃ １细胞的荧光素酶活性明显降低（Ｐ＜０．０５）；而ｍｉＲ ＮＣ、ｍｉＲ １７ ５ｐ分别与ＭＵＴ ＭＡＰ３Ｋ１４共转染后，Ｐａｎｃ １细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），可见ＭＡＰ３Ｋ１４对ｍｉＲ １７ ５ｐ具有靶向作用。与ｐｃＤＮＡ３．１组比较，ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组中ｍｉＲ １７ ５ｐ表达水平明显降低（Ｐ＜０．０５）；相反，ｓｉ ＭＡＰ３Ｋ１４组中ｍｉＲ １７ ５ｐ表达水平明显高于ｓ
ｉ ＮＣ组（Ｐ＜０．０５）。ＭＡＰ３Ｋ１４可负向调控ｍｉＲ １７ ５ｐ表达。见图２，表５、６
。
图２ ＭＡＰ３Ｋ１４的３’ＵＴＲ中含有ｍｉＲ １７ ５ｐ的互补核苷酸序列婚育与健康
２．４ 过表达ｍｉＲ １７ ５ｐ能逆转ＭＡＰ３Ｋ１４对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响 ２４ｈ作用时间下，ｐｃＤＮＡ３．１组、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组、ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋
表５ 双荧光素酶报告实验
ｎ＝３，珋ｘ±ｓ组别ＷＴ ＭＡＰ３Ｋ１４ＭＵＴ ＭＡＰ３Ｋ１４ｍｉＲ ＮＣ组 １．１１±０．０４１．１６±０．０４ｍｉＲ １７ ５ｐ组
０．５３±０．０２１．２１±０．０５ｔ值２２．４６３１．３５３Ｐ值
０．０００
０．２４８
湖北省其他事业单位实施绩效工资指导意见表６ ＭＡＰ３Ｋ１４对ｍｉＲ １７ ５ｐ表达的影响ｎ＝３，珋
ｘ±ｓ 组别ｍｉＲ １７ ５ｐｐｃＤＮＡ３．１组
０．４８±０．０４
ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组０．１６±０．０１
ｓｉ ＮＣ组０．５３±０．０５ｓｉ ＭＡＰ３Ｋ１４组１．３８±０．１１＃ Ｆ值２００．１６６
Ｐ值
０．０００
注：与ｐｃＤＮＡ３．１组比较， Ｐ＜０．０５；与ｓｉ ＮＣ组比较，＃Ｐ＜０．０５
ｍｉＲ ＮＣ组和ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ １７ ５ｐ组细胞的增殖能力差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；４８ｈ和７２ｈ作用时间下，ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组细胞的增殖能力较ｐｃＤＮＡ３．１组明显减弱（Ｐ＜０．０５），ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组与ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ组间差异无统计学意义（
Ｐ＞０．０５），但ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ １７ ５ｐ组较ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ组明显升高（Ｐ＜０．０５）。同时，ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组细胞的凋亡率能力明显高于ｐ
ｃＤＮＡ３．１组（Ｐ＜０．０５），ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ １７ ５ｐ组明显低于ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ组（Ｐ＜０．０５），而ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组与ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋
ｍｉＲ ＮＣ组间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ｍｉＲ １７ ５ｐ过表达可显著逆转ＭＡＰ３Ｋ１４对胰腺癌ｐａｎｃ １细胞增殖的抑制作用、逆转对细胞凋亡的促进作用。见表７
。表７ 过表达ｍｉＲ １７ ５ｐ能逆转ＭＡＰ３Ｋ１４对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响
ｎ＝３，珋ｘ±ｓ 组别细胞活性（
ＯＤ４９０ｎｍ）２４ｈ４８ｈ７２ｈ凋亡率（％）ｐｃＤＮＡ３．１组
０．４８±０．０２
０．９７±０．０４
１．５１±０．１０
７．６６±０．３４
ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４组
０．３６±０．０２
０．４７±０．０２
０．６１±０．０４
１９．６９±１．０３
ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ组０．３８±０．０１
０．５１±０．０２
０．６３±０．０３
１９．９２±１．１６ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ １７ ５ｐ组０．４３±０．０２
＃０．７８±０．０３
＃１．２４±０．０６
＃１２．０２±０．０８＃ Ｆ值２６．６９２２０２．５１５１５０．７２７
１７２．１６９
Ｐ值
０．０００
０．０００
０．００００．０００
注：
与ｐｃＤＮＡ３．１组比较， Ｐ＜０．０５；与ｐｃＤＮＡ３．１ ＭＡＰ３Ｋ１４＋ｍｉＲ ＮＣ组比较，＃Ｐ＜０．０５３ 讨论
胰腺癌的恶性程度非常高，它具有起病隐匿、手术
切除率小、预后不良、病死率高、生存率低等特点。目前根本的原则依然是以外科为主，放化疗为
辅。手术是唯一可能根治的方法，但因胰腺癌的早期诊断困难，易早期发生侵袭转移，故手术切除率低、预后不良、术后生存率低。放化疗是肿瘤综合中的重要环节，但胰腺癌对化疗药的反应程度不明显，对放疗不敏感，故对于延长晚期胰腺癌患者的生存时间作用有限。
长链非编码ＲＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎ ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｌｎｃＲＮＡ）其本身不编码蛋白，但研究发现它们在多种层面实现对基因的调控，将类似功能归纳为转录调控、转录后调控和表观遗传学调控３个主要层面［９］。ＬｎｃＲＮＡ的表达或功能异常与人类众多疾病的发生密切相关，如癌症、阿尔兹海默症、糖尿病等，具体表现为ＬｎｃＲＮＡ在序列、空间结构、表达水平及与结合蛋白相互作用上的异常等。研究发现ＬｎｃＲＮＡ与人类多个肿瘤的发病联系密切，可以在多个水平参与基因表达调控网络的构成，调控肿瘤的发生、发展，并与肿瘤的侵袭、转移及患者预后联系密切［１０］，其有望成为潜在的诊断标志物和的靶点。有研究证明，长链非编码ＲＮＡＭＡＰ３Ｋ１４在胰腺癌组织中下调表达，ＭＡＰ３Ｋ１４属于丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）超级家族，能介导刺激信号从细胞膜传递到细胞核或其他胞内靶点，能够调节细胞的增殖、分化、细胞周期和凋亡等［１１］；本研究通过ＲＴ ＰＣＲ法检测到胰腺癌组织中ＭＡＰ３Ｋ１４的表达较正常胰腺组织显著下调，通过过表达胰腺癌细胞中ＭＡＰ３Ｋ１４，发现ＭＡＰ３Ｋ１４能抑制胰腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，证实ＭＡＰ３Ｋ１４是抑癌基因，但ＭＡＰ３Ｋ１４对胰腺癌细胞的生物学行为的具体机制尚不清楚。相关研究发现，ｌｎｃＲＮＡ可以通过稳定某些抑癌基因的ｍＲＮＡ以及蛋白来促进
癌细胞的生长发育及转移［１２］，且在生物中，ｌｎｃＲＮＡ和ｍｉＲＮＡ往往是共同作用的，它们之间可以协同调节，也存在相互调节［１３］。有研究发现ｍｉＲ １７ ５ｐ为癌基因在胰腺癌细胞中上调表达可促进癌细胞增殖、迁移［１４］。ｍｉＲＮＡ是内源性非编码短链ＲＮＡ，在转录后水平调节血管生成及细胞周期、凋亡、侵袭和迁移等肿瘤相关基因的表达，进一步影响肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭［１５］，所以我们猜测ＭＡＰ３Ｋ１４可能是通过调控ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达来影响胰腺细胞的增殖、凋亡。我们采用双荧光素酶报告基因实验验证发现ｍｉＲ １７ ５ｐ的３’ＵＴＲ上存在ＭＡＰ３Ｋ１４的互补结合序列。通过过表达胰腺癌Ｐａｎｃ １细胞中的ＭＡＰ３Ｋ１４，发现ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达量相对下降，沉默ＭＡＰ３Ｋ１４的表达，ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达量相对上升，证实ＭＡＰ３Ｋ１４可负向调控ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达，再进一步研究，通过过表达胰腺癌Ｐａｎｃ １细胞中ｍｉＲ １７ ５ｐ，发现ｍｉＲ １７ ５ｐ可以逆转ＭＡＰ３Ｋ１４对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响。表明ＭＡＰ３Ｋ１４通过下调ｍｉＲ １７ ５ｐ的表达来抑制胰腺癌细胞的增殖、促进细胞凋亡。
胰腺癌的发生发展是一个很复杂的过程，是多因素共同参与、多基因协同作用、综合发展的结果［１６］，因此到有效的诊断新方法是提高胰腺癌效果的关键所在。通过深入研究ＭＡＰ３Ｋ１４在胰腺癌发生、发展中的作用，有可能从另一方面揭示胰腺癌的发病机制，为胰腺癌诊断提供新的生物标志物，为胰腺癌的提供新靶点，以期抑制癌症的复发和转移，提高临床疗效。
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（收稿日期：２０２０－１０－１６）
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