DOI：10.13822/jki.hxsj.2021007784化学试剂,2021,43(1),22〜27 Btk/JAK3双靶点共价抑制剂的设计、合成及其活性研究 曹思思’，张洁=曾宪霞黄怀怔岳晓阳b，何林洪"
(广西医科大学a•药学院，b.基础医学院，广西南宁530021)
摘要：布鲁顿式酪氨酸激酶(B4)和两面神激酶3(JAK3)均是自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤的潜力靶标。以4-氯毗咯并喘咙为原料，经7步反应合成了…系列7/7-毗咯并［2,3-d］陀唳4胺衍生物，其结构经'HNMR J3CNMR和MS (ESI)分析证实。体外依次考察了所得化合物分别对Btk和JAK3激酶的活性、以及对部分B淋巴细胞瘤细胞系的抗增殖活性。结果表明，四氢毗咯烷基取代的衍生物NB1~4对Btk(7C50<3nmol/L)和JAK3(心。<165nmol/L)均能有效抑制，其余化合物只对Btk显示抑制效果；而且NB2和NB4对所测试的多种B细胞淋巴瘤细胞系的抗增殖活性均优于阳性对照泛激酶抑制剂依鲁替尼及Btk单靶点抑制剂。其中，对Jeko-1细胞的抑制能力最佳(/C5O<3pmol/L)，苴次是OCI-LYI(/C50<4p,mol/L)x SUDHL-6(7C5O<6^mol/L)和HBL-1 *(7C5O<6.5pjnol/L)，最差为SUDHL-4细胞(心。<11 |xmol/L)o这些发现可为开发B细胞淋巴瘤的多靶点药物提供新的思路。
关键词:Btk；JAK3；双靶点；共价抑制剂；B细胞淋巴瘤
中图分类号：0626.13文献标识码：A文章编号：0258-3283(2021)01-0022-06
Design,Synthesis and Bioactivity of Btk/JAK3Dual Target Covalent Inhibitors CAO Si-sf,ZHANG Jie",ZENG Xian-xia B, HUANG Huai-zheng&,YUE Xiao-yang^,HE Lin-hong*"(a.Pharmaceutical College,b.School of Basic Medical Sciences,Guangxi Medical University,Nanning530021,China),Huaxue Shiji,2021,43(1),22~27
Abstract:Bruton r s tyrosine kinase(Btk)and Janus kinase3(JAK3)are very promising targets for hematological malignancies and autoimmune diseases.A series of4-amino-7H-pyrrolo[2,]pyrimidine derivatives were synthesized via seven steps,by using 4-chloro-7//-pyrrolo[2,3-J]pyrimidine as raw material,and all the target compounds were confirmed by1HNMR,13CNMR and MS(ESI).The bioactivity tests against Btk and JAK3were carried out,as well as the anti-proliferative ability against selected B-cell lymphoma.Among them,derivatives substituted with tetrahydropyrrolidinyl NB1〜4significantly inhibited Btk(/C5O<3nmol/ L)and J AK3(fC50<165nmol/L)；others can only inactive Btk.Moreover,both compounds NB2and NB4showed strong activities to block the proliferation of B-cell lymphoma cells compared with the positive control pan-inhibitor ibrutinib and other Btk inhibitors.The inhibitory potency against Jeko-1was the best,followed by OCI-LYI(/C50<4pimol/L),SUDHL-6(/C5O<6pumol/L)and HBL-1*(/C5O<6.5pimol/L),while SUDHL-4being the worst(/C50<11jxmol/L).Th
ese findings could provide a new insight for the development of novel anti-B-cell lymphoma drugs with multi-target actions.
Key words：Bruton's tyrosine kinase(Btk)；Janus kinase3(JAK3)；double target；covalent inhibitor；B-cell lymphoma
布鲁顿式酪氨酸激酶(Btk)是非受体酪氨酸激酶Tec家族的除T细胞外在造血细胞中广泛表达的一种激酶⑴。作为B细胞受体(BCR)信号通路的关键组成部分，Btk被BCR及其抗原结合所引发的级联反应激活，升高细胞内钙离子浓度，激活MAPK s、NF-k B和AKT等信号通路，调控基因和细胞因子的表达，影响B细胞的存活、增殖和分化2〕。而在骨髓细胞中的Btk则可以被Fey受体R(FcyR)和免疫复合体(IC)激活，诱导INF-a、IL-10和IL-6等细胞因子的产生"引。此外，胶原诱导的关节炎模型证实抑制Btk可以阻断B细胞受体依赖的B细胞增殖，并同时降低自身抗体水平；在多种B细胞恶性肿瘤中观察到Btk的异常表达［4-5!o因此，作为免疫受体信号通路中的关键激酶，Btk已然成为自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤的优势靶标，其上市药物依鲁替尼(ibrutinib)于2013年11月获批用于套细
收稿日期：2020-07J8；网络首发日期:2020-11-03
基金项目：广西医科大学青年科学基金项目(GXMUYSF-201732)；国家自然科学基金青年科学基金项目
(81803350)；广西医科大学基础医学院青年基金项目(GX-MUBMSTC-D03)；广西医科大学大学生创新性实验项目
(201910598299.201910598128)o
作者简介：曹思思(1987-)，男，湖北大冶人，博士，讲师，主要研究方向为抗肿瘤药物靶点发现。
通讯作者：何林洪，E-mail:HLhongedu@163
引用本文：曹思思，张洁，曾宪霞，等-Btk/JAK3双靶点共价抑制剂的设计、合成及其活性研究［J］•化学试剂，2021, 43(1)：22-27o
胞淋巴瘤(MCL)的，对于关风湿关节炎的研究也处于临床研究阶段。
两面神激酶3(JAK3)，隶属JAK非受体酪氨酸激酶家族"切.同样发现在细胞因子诱导的正常和白血病B细胞前体的增殖和存活中起到重要作用。除了调节信号传导及转录激活因子3 (STAT3)、信号传导及转录激活因子5(STAT5)和激活蛋白1的活性外，还调节抗凋亡PI3K-AKT 通路及其下游蛋白，包括重要的致癌蛋白[，°'"]o 目前,JAK3已成为了血液系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病的潜力靶标ll°'"1o分析Btk和JAK3的蛋白晶体结构，它们在ATP结合口袋绞链区相近位置均存在半胱氨酸残基⑻，这为开发Btk和JAK3双靶点共价抑制剂用于B细胞恶性肿瘤和自身免疫性疾病的提供了结构基础。
在前期研究中，我们以泛激酶抑制剂依鲁替尼为先导化合物，通过结构修饰以改善其激酶选择性，成功获得高选择性Btk抑制剂OB1(见下图)[12]o本文以0B1为苗头化合物，保留毗咯烷C-3位上的优势碎片胡椒环基和苯氧基苯基官能团，亲电碎片则选择内烯酰基和内烯磺酰基，更换亚甲基哌陀基同系物以考察毗咯环N-1位和亲电碎片间的连接子(Linker)长度及杂环种类，设计并合成了一系列7H-毗咯并胺衍生物。其中，化合物0B1-14已在本课题组的其他论文中发表⑶，NB1〜6为首次披露于本文。本文对所合成的化合物分别进行了体外Btk、JAK3酶活力，以及B细胞淋巴肿瘤细胞系的抗增殖能力筛选，以获得高效的Btk和JAK3双靶点共价抑制剂。所有化合物的结构经'HNMR、“CNMR和MS(ESI)分析证实，具体合成路线如下所示。
X N-碘代丁二酰亚胺，?}
厂丫、四氢咲哺，室温,2h N^rA.
311
N"'N
4H
+
,?.H
Boc
1
，
三乙胺，二氯甲烷
室温,2h
2
氨水
1,4-二氧六环
98尤，过夜
氯化氢
1,4-二氧六环
50弋.过夜
•w
F1
碳酸艳
MN-二甲基甲酰胺I詁f
ioor,4h
Boc
5
[1』-双(二苯基■基)
二茂铁]二氯化锂
碳酸钾
1,4-二氧六环/水
98匸3~4h
N,N-二异丙基乙胺
超干二氯甲烷
室温」hlw6-220
平HC1
H
8NB1-6;0B1-14
Btk/^=0.81nmol/L Btk7^=21.70nmol/L JAK3/^=16.1nmoi/L JAK3ZC so>lOOOO nmol/L BIk ZC30=0.5nmol/L Blk ZC so=5O3.7nmol/L Bmx/C J0=0.8nmol/L Bmx/C50=61.5nmol/L EGFR/C50=5.6nmol/L EGFR ZC30>10000nmol/L
提高JAK3的抑制活力
江西省教育资源公共服务平台Linker:•/W
O
H
S
n
o R"R12
标题化合物的合成路线
维护国家五大安全Synthetic route of the title compounds
o n s n
o
Btk和JAK3双靶点抑制剂的设计Design of Btk and JAK3dual target inhibitors 1实验部分
1.1主要仪器与试剂
INOVA400/54型核磁共振仪(美国
Varian
公司)；AL204型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Q-TOF(ESI)型质谱仪(英国Micromass 公司)。
、三乙胺(Et’N)、N-碘代丁二酰亚胺(NIS)J1,T-双(二苯基麟基)二茂铁］二氯化耙(PdCl2(dppf))、丙烯酰氯、2-氯乙烷磺酰氯、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、碳酸艳(CS2CO3)、超干二氯甲烷(DCM)(98%，萨恩化学技术(上海)有限公司)；漠化锂、碳酸钾(“CO,)(上海毕得医药科技有限公
司)。其他常用试剂如无水硫酸钠(Na2SO4)，四氢咲喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、石油瞇均为分析纯，未经处理直接使用。
1.2中间体2的合成
将含20mmol N-Boc的哌噪/D比咯原料(1)和150mL溶剂DCM置于冰浴下搅拌，依次加入40 mmol Et,N和30mmol，移到室温中继续搅拌2h，逐渐生成无机盐固体。过滤除去无机盐，收集滤液，依次用水、饱和食盐水多次萃取滤液，无水Na2SO4干燥油层，减压浓缩得黄油状物中间体2，产率约为63%，无需纯化，直接用于下一步反应。
1.34-氯-5-碘-7H-11比咯并［2,3-d］唏睫(4)的合成
将20mmol4-氯毗咯并唏唳(3)和50mL溶剂THF置于室温中搅拌，在氮气保护下多次少量加入21mmol NIS，约2h后反应液由混悬状态变澄清。减压旋干反应液，加水将固体分散，过滤收集滤饼，并用大量的水洗涤滤饼，再低温烘干滤饼得红棕固体产物4，产率为96%。
1.4中间体5的合成
将11mmol中间体2、10mmol化合物4、11 mmol Cs2CO3和15mL溶剂DMF的混合物置于100覽反应4h，倒入水中.EtOAc萃取3次，合并有机相，并用饱和食盐水萃取3次有机相，经无水Na2SO4干燥，
减压旋干，残余物经过硅胶层析柱(石油瞇/EtOAc梯度洗脱)分离纯化，得到白固体中间体5，产率75%0
1.5中间体6的合成
将中间体5、适量的1,4-二氧六环和25%的浓氨水置高压反应釜中98七反应过夜。将反应液冷却至室温，高压反应釜的压力显示为0，取出反应液.减压浓缩除去溶剂，加水分散所得固体，过滤收集滤饼，多次少量地用水洗涤滤饼，低温烘干滤饼即得中间体6，产率56%。1.6中间体7的合成
通过Suzuki反应完成中间体7的合成，即将 3mmol中间体6、3.3mmol硼酸衍生物、9mmol K2CO3和0.3mmol PdCl2(dppf)置于三颈瓶中，多次用N2置换三颈瓶中的空气以确保反应瓶中含氧量极低，用注射器将30mL«1,4-二氧六环)：卩(水)=8：2混合溶剂打入反应瓶，移至98T加热3~4h。冷却至室温，使用硅藻土作助滤剂，过滤反应液收集滤液并减压旋蒸除去溶剂。EtOAc溶解残余物，并用水萃取3次，合并有机相，并用饱和食盐水萃取3次有机相，经无水Na2SO4干燥，减压旋干，残余物经过硅胶层析柱(石油醞/EtOAc梯度洗脱)分离纯化，得到白固体中间体7，产率为43%。
1.7中间体8的合成
用少量的1,4-二氧六环溶解中间体7，加入1.4-二氧六环饱和的氯化氢溶液，于50t加热过夜，减压旋干反应液即得盐酸盐中间体8，无需纯化，直接用于下一步，产率为69%。
1.8目标产物的合成
将0.5mmo］盐酸盐中间体8置于冰浴中，加入3mL超干DCM作溶剂，随后滴加3mmol DIEA和0.5mmol丙烯酰氯或0.5mmol2-氯乙烷磺酰氯，搅拌1h。DCM萃取反应液3次，合并有机相，经无水Na^SO。干燥，减压旋干，残余物经过硅胶层析柱(DCM/MeOH梯度洗脱)分离纯化，得到白固体目标产物，产率约33%。
(R)亠(3-(4-氨基-5-(苯并［d］［1,3］二噁五-5-基)-7H-毗咯并［2,3-d］曙睫-7-基)毗咯烷-1- 基)-2-丙烯-1-酮(NB1)：'HNMR(DMSO-d—400MHz),5:8.15(s,1H C4N,H)；7.42~7.27 (m,1H,—C6H3)；7.02(s,1H,—C6H3)；7.00 (dd,1H,/=4.4,1.4Hz,—C6H3)；6.93-6.89 (m,1H,—C4NH)；6.62(ddd,1H,J=25.1,16.8, 10.3Hz,—COC2H3)； 6.27~ 6.09(m,3H,—COC2H3+—NH2)；6.06(s,2H，—C3O2H2)；
5.69(ddd,1H,J=17.8,10.3, 2.4Hz,—COC2H3)；5.43~5.27(m,1H,—C4NH7)；3.94 (dd,1H,J=12.5,7.1Hz,—C4NH7)；3.87(dd, 1H,J=10.1,7.6Hz,—C4NH7)；3.78~3.69(m, 2H,—C4NH7)；2.45(dd,1H,J=13.8,
6.7Hz,—C4NH7)； 2.36(dd,1H,J=14.1, 6.7Hz，一C4NH7)。,3CNMR(DMSO-J6,101MHz),8：163.96,15
7.75,152.07,150.68,14
8.18,146.82,
129.76,127.49,122.26,120.82,116.18,109.49, 109.12,101.57,100.68,53.34,52.04,45.04, 31.57。ESI-MS,m/z：378.10[M+H]+o
(R)・5・(苯并[d][l,3]二氧环戊烷・5■基)・7・((1■(乙烯基砚)四氢毗咯烷・3■基)・7/M比咯[2,3・d]喘噪-4・胺(NB2)：'HNMR(DMSO-J6,400 MHz),8：8.15(s,1H,—C4N2H)；7.37(s,1H,—C6H3)；7.02(d,2H，丿=8.1Hz,—C6H3)；6.94 (dd,2H,J=16.6,9.8Hz,—C4NH+—SO2C2H3)；
6.34〜6.10(m,4H,—SO2C2H3+—NH2)；6.07 (s,2H,—C3O2H2)；5.35〜5.23(m,1H,—C4NH7)；
3.72(dd,lH,J=10.3,7.2Hz,—C4NH7)；3.58~ 3.49(m,2H,—C4NH7)；3.40(dd,1H,J=17.6, 7.6Hz,—C4NH7)；2.45~2.34(m,2HC4NH7)o 13CNMR(DMSO-J6,101MH z),5：157.76,152.09, 150.64,148.19,146.83,132.23,129.47,128.74, 122.26,120.89,116.20,109.50,109.15,101.58, 100.70,53.12,52.22,46.63,31.05o ESI-MS, m/z：41
4.21[M+H]+O
(/^)-1-(3-(4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7/7-毗咯[2,3・d]l^lg-7-基)四氢毗咯烷亠基)・2■丙烯・1-酮(NB3)：'HNMR(DMSO-</6,400MH z),5：8.17 (s,1H,—C4N2H)；7.47(d,2H，丿=6.7Hz,—C6H4)；7.40(dd,3H,J=17.8,10.1Hz,—C6H5+—C6H4)；7.16(t,lH，丿二7.3Hz,—C6H4)；7.09 (t,4H，丿= 6.7Hz,—C4NH+—C6H5)；6.62 (ddd,1H,J=24.3,16.7,10.3Hz,—COC2H3)；
6.33~6.00(m,3H,—COC2H3+—NH2)；5.76~ 5.65(m,1H,—COC2H3)；5.44~5.29(m,1H,—C4NH7)；3.93〜3.84(m,lH,—C4NH7)；3.79~ 3.68(m,2H,—C4NH7)；3.58~ 3.49(m,1H,—C4NH7)；2.48~2・43(m,lH,—C4NH7)；2.41〜2.34(m,1HC4NH7)o,3CNMR(DMSO-J6,101 MHz),5：164.61,15
7.76,157.20,155.94, 152.08,150.93,130.54,130.47,130.38,129.01, 127.42,124.34,123.94,119.62,119.11,114.84, 100.27,53.33,52.10,46.61,31.51o ESI-MS, m/z：426.26[M+H]+O
(R)・5・(4・苯氧基苯基)・7・(1-(乙烯基砚)四氢毗咯烷・3■基)・7H■毗咯[2,3/]喀喘・4-胺(NB4)：'HNMR(DMSO-d6,400MHz),5：8.15(s, 1H,—C4N2H)；7.49(d,2H,J=8.5Hz,—C6H4)；
7.42(t,3H,/=7.9Hz,—C6H5+—C6H4)；7.16 (t,lH,/=7.4Hz,—C6H4)；7.10(t,4H，丿=8.3Hz,—C4NH+—C6H5)；6.94(dd,1H,J=16.5, 10.0Hz,—SO2C2比)；6.26~ 6.12(m,4H,—SO2C2H3+—NH2)；5.31(
p,lH,/=6.8Hz, C4NH7)； 3.73(dd,1H,J=10.4,7.1Hz,—C4NH7)； 3.54(dd,2H,J=16.0,9.7Hz,—C4NH7)；3.45〜3.36(m,1H,—C4NH7)；2.41 (dd,2H,J=13.8,6.3Hz,—C4NH7)。,3CNMR (DMSO-J6,101MH z),5：157.79,157.18,156.01, 152.16,150.87,132.31,130.54,130.49,130.28, 129.03,123.96,119.61,119.14,115.24,100.30, 53.21,52.04,46.31,31.21o ESI-MS,m/z：462.23 [M+H厂。
5・(苯并[d][1,3]二氧环戊烷・5■基)-7-(2-(1■(乙烯基砚)哌唳・4■基)乙基)・1H・毗咯[2,3・d]喘噪・4-胺(NB5):1HNMR(DMSO-J6,400 MHz),5：8.12(s,1H,—C4N2H)；7.31(s,1H,—C6H3)；7.00(dd,2H,J=7.8,4.7Hz,—C6H3)；
6.89(dd,lH,/=
7.9,1.6Hz,—C4NH)；6.75(dd, 1H,J=16.6,10.0Hz,—COC2H3)；6.18~6.03 (m,6H,—COC2H3+—NH2+—C3O2H2)；4.18 (t,2H,J=7.1Hz,—C2H2—)；3.48(d,2H,J=
12.1Hz,—C5H9)；2.57~2.52(m,2H C5H9)；
I.83(d,2H,J=10.6Hz,—C5H9)；1.75(dd,2H,
13.4,6.7Hz,—C5H9)；1.24(d,3H,J=5.6 Hz,—C2H2—+—C5H9)。13CNMR(DMSO-J6, 101MHz),8：
157.63,151.93,150.43,148.17, 146.69,132.23,129.18,129.06,127.35,123.48, 122.24,115.48,109.43,109.14,101.55,100.44, 45.60,41.98,41.65,36.61,33.33,32.81,31.77o ESI-MS,m/z：456.20[M+H]+o
5-(4-苯氧基苯基)-7-(2-(1■(乙烯基矶)哌睫・4-基)乙基)・7弘卩比咯[2,3d]嗨噪-4-胺(NB6)：,HNMR(DMSO-J6,400MHz),5：8.14(s, 1H,—C4N2H)；7.48~7.38(m,4H,—C6H5+—C6H4)；7.36(s,1H,—C6H4)；7.16(t,1H,J= 7.4Hz,—C6H4)；7.09(dd,4H,J=8.0, 5.5 Hz,—C4NH+—CeU)；6.76(dd,1H，丿=16.5, 10.0Hz,—SO2C2H3)；6.09(dd,4H,J=15.7, 13.3Hz,—SO2C2H3+—NH2)；4.20(t,2H,J= 7.0Hz,—C2H2—)；3.49(d,2H,J=12.0Hz,—C5H9)；2.57~2.51(m,2H)；1.83(d,2H，丿二II.2Hz,—C5H9)；1.76(dd,2H,J=13.2,6.9 Hz,—C5H9)；1.24(d,3H,J=5.6Hz,—C2H2—+—C5H9)。,3CNMR(DMSO-J6,101MHz),8：
157.72,157.21,155.93,152.12,150.70,132.20, 130.55,130.48,129.08,127.26,123.90,123.62, 119.65,119.12,115.07,100.31,45.62,41.95, 41.63,36.65,33.34,32.81,31.77o ESI-MS,m/z：504.03[M+H]
*o
目标化合物OB1~14的'HNMR J'CNMR和ESI-MS详见参考文献[12,13]。
1.9Btk和JAK3的激酶活性研究
体外Btk和JAK3的激酶活性测试与上海睿智化学研究有限公司合作完成。化合物先在100J000nmol/L浓度下测定抑制率，挑选在1000nmol/L浓度下抑制率超过50%化合物在梯度浓度下测定疋‘。值。
1.io B细胞淋巴肿瘤细胞系的抗增殖活性研究
采用MTT法测定细胞毒性，实验细胞为套细胞淋巴瘤（M CL）Jeko-1；生发中心样弥漫大B细胞淋巴瘤（GCB-DLBCL）SUDHL-4、SUDHL-6和0CI-LY1；活化B细胞样弥漫大细胞淋巴瘤（ABC-DLBCL
*）HBL-1
*o采用96孔板进行体外活性测试，培养温度为37P，加入梯度浓度化合物处理72h后测定抑制率，选用Graphpad prism 6.0软件拟合剂量-响应曲线得/Cs。值。
2结果与讨论
2.1目标化合物的波谱分析空客开发飞行出租
目标化合物NB1~6和OB1~14的结构通过'HNMR、"CNMR和MS（ESI）进行了表征，现以NB1为例予
以说明。从'HNMR可知，喘睫环上的氢.化学位移88.15，积分1个氢，单峰。胡椒环苯基C6'-H、C5'-H的化学位移分别是57.34、37.00，积分均为1个氢，多重偶合；胡椒环苯基C2--H的化学位移是87.02，积分1个氢，单峰；胡椒环基团上亚甲基的化学位移86.06，积分2个氢，单峰。毗咯环上的氢，化学位移56.93-6.89，多重偶合。端头烯氢的化学位移分别是85.69、$6.17，积分均为1个氢，经典ddd峰；与按基相邻的烯氢由于受到强的吸电子效应，较端头烯氢处于更低场，化学位移8 6.62，积分1个氢，也是ddd峰。其中，喀睫环上的伯胺基则被包裹于化学位移$6.27-6.09的氢中，与56.17的峰一起积分为3个氢。四氢毗咯烷基CT-H的化学位移85.42-5.27，积分1个氢，多重峰；C2，两个氢的化学位移分别是83.94,33.87，积分均为1个氢，dd峰；C4，两个氢的化学位移是83.77-3.69、积分两个氢.多重峰；C5，两个氢的化学位移分别是& 2.36.5 2.45，积分均为1个氢，dd峰。从“CNMR可知,Linker饱和杂环的化学位移均处于高场，其他碳原子出峰数与化合物实验式相符。再根据ES1-MS确定其分子量为377，最终确证其结构。袁大炳
2.2目标化合物的激酶活性
本实验分别测定了目标化合物0B1~14、NB1-6对Btk和JAK3的酶活抑制，实验结果如表1所示。除了OB7化合物外，其余化合物均能有效抑制Btk激酶。其中,Linker为C-3四氢毗咯烷基取代的化合物NB1~4为双靶点抑制剂，毗咯烷基C-3位以胡椒环基取代者对Btk的抑制效果优于苯氧基苯基取代者，而亲电碎片以丙烯磺酰基取代者对JAK3的抑制活力优于丙烯酰基者，同样的结果可见于化合物OB3和
OB4。Linker以C2-亚甲基四氢毗咯烷基（OB11-14）和C3-亚甲基四氢毗咯烷基取代（OB7~10）的衍生物，在毗咯烷基C-3位以苯氧基苯基取代者（OB9、OB10、OB13、OB14）对Btk的抑制活性明显优于胡椒环基取代者（OB7、0B8、OB11、OB12）。Linker为C4-亚甲基哌睫基取代的衍生物，以丙烯磺酰基（OB2、OB4）作为亲电碎片的目标产物对Btk的抑制能力优于丙烯酰基者（OB1、OB3）。Linker为C4-亚乙基哌睫基取代的衍生物OB5、OB6、NB5、NB6，对Btk有一定的抑制活力。
表1目标化合物NB1~6,OB1~14对Btk和
JAK3的激酶活性注
Tab.l Enzyme activity of target compounds NB1~6,
战前战后OB1~14against Btk and JAK3
(/C50/(nmol-L_,))
编号Btk JAK3编号Btk JAK3
NB1 1.4117.20B6597.8>1000 NB2 1.5140B7>1000>1000 NB3 2.5161.10B8 2.1>1000 NB4 2.93
4.40B9 6.5>1000 NB553.2>1000OB10 1.4>1000 NB629>1000OBI1932>1000 OBI21.7>10000B1288.6>1000 OB2 1.3>10000B13 1.2>1000 OB3 6.1>10000B14 4.4>1000 OB4 4.2423依鲁替尼0.816.1
0B536.8>1000
注：/C50值是两次独立实验的平均值，分别在相应激酶的Km ATP浓度中测试所得（5nmol/L Btk对应90jimol/L ATP；4nmol/L JAK3对应6.2pimol/L ATP）o
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