3国家自然科学基金(N o.20075012)资助项目
33通讯联系人：沈含熙，教授，博导,E 2mail :hxshen @ey ou
黄艳萍1,2 孔德明1 柴鼎赓1 沈含熙133 宓怀风1
(1.南开大学化学学院，高分子功能材料吸附与分离国家重点实验室 天津 300071)
(2.天津医科大学药学院 天津 300070)摘 要 端粒酶是目前最广谱的恶性肿瘤的预警标志物，其活性对大多数恶性肿瘤的诊
断均具有较高的敏感性和特异性。本文针对端粒酶延伸产物序列的特殊性，开发一类新型发夹型引物。该引物具有的发夹结构使得PCR 扩增只能在加热条件下启动。运用这项技术，建立用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性的新方法。减少非特异性扩增产物及引物二聚体的生成，提高检测的专一性。将该法用于恶性肿瘤细胞提取物中端粒酶活性的检测，取得满意的结果。关键词 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 发夹型引物 端粒酶 聚合酶链式反应 基因检测 引言
端粒酶是一种独特的具有逆转录酶功能的核糖
核蛋白酶，主要功能是合成端粒重复序列(5’-GG TT AG-3’)并维持端粒序列长度(10～50kb )。
由于其在良性肿瘤和正常细胞中几乎无活性，而在大多数恶性肿瘤细胞中均能检测到其活性。因此，端粒酶被公认为是目前最广谱的恶性肿瘤的预警标志物，其活性对大多数恶性肿瘤的诊断均具有较高的敏感性和特异性1。检测端粒酶活性的“端粒重复扩增法”(telemetric repeat am plification protocol ,TRAP )2，是评估端粒酶是否为肿瘤标志物的重要
手段。最初的TRAP 法分为三步：第一，端粒酶以自身RNA 的片段为模板，在作为端粒酶底物(telomerase substrate ,TS )的寡核苷酸链的末端添加端粒重复序列，生成端粒酶延伸产物；第二，聚合酶链式反应(P olymerase Chain Reaction ,PCR )用TS 作上游引物对该延伸产物进行扩增；第三，扩
增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后用放射自显影检测。由于TRAP 法中端粒酶延伸产物经过PCR 大量扩增，因此，方法灵敏度很高，但该法采用石蜡覆
盖下游引物的热启动(hot start )方法，操作繁琐。并且使用的下游引物易引起非特异性扩增产物，造成假阳性结果。为此，许多研究者对其进行改进3。其中改良型TRAP 法4提出一个新的下游引物ACX ，
该引物不仅在整个序列中引入三个错配碱基，而且在5’末端加入一段与延伸无关的锚定序列，从而阻
止端粒酶延伸产物在此端的延伸，避免了假阳性结果的出现。因而得到广泛的应用，但该法在不进行热启动的条件下，存在非特异性扩增产物的干扰。在ACX 引物的基础上，设计出一个新的发夹型引物ACX M ，该引物具有的发夹结构使得PCR 扩增只能在加热条件下启动。运用这项技术，建立一种用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性的新方法，并以人工合成的不同长度的端粒酶延伸产物为检测对象，对该法在提高检测专一性方面的效果进行了研究；同时，将该法用于恶性肿瘤细胞中端粒酶活性的检测取得满意的结果。雅芳贿赂门>精神专科
1 实验部分
111 仪器与试剂
PCR 热循环仪(英国,Hybaid Limited ),TG L -16G 冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),WH -861漩涡混合器(上海环球物化仪器厂)，恒压恒
流DF -D 型电泳仪(北京东方特力科贸中心)，凝胶成像系统(英国,UVI tech 公司)。TS :5’-AATCCG TCG AG C AG AG TT-3’，下游引物ACX:5’-G CG CGG [CTT ACC]3CT AACC -3’(划线部分为错配
的碱基，这三个错配碱基的引入是为避免引物二聚体的PCR 产物对结果造成的影响)4;ACX M :5’-GG
TT AG [CTT ACC]3CT AACC -3’(划线部分为错配
的碱基)以及人工合成的寡核苷酸R5:5’-AATC 2CG TCG AG C AG AG TT AG [GG TT AG]4-3’。R6:5’-AATCCG TCG AG C AG AG TT AG-[GG TT AG]5-3’以及
1
4二○○四年・第四期
研制与开发
R7:5’AATCCG TCG AG C AG AG TT AG[GG TT AG]6-3’(分别代表被端粒酶合成4～6个端粒重复序列的端粒酶延伸产物)均由上海生工生物技术工程公司合成。其它生物试剂亦购自于该公司。
112 实验方法
11211 端粒酶的提取 取白血病细胞H L-60约2×106个，用3000转/min离心机分离沉淀细胞，用洗液[10mm ol/L Hepes-K OH(pH=715), 115mm ol/LMgC12,1mm ol/L DTT(二硫苏糖醇), 10mm ol/L K C1]洗涤两次，于4℃，以10000转/ min离心收集沉淀。将沉淀置于115m L离心管中，加入200μL裂解液[10mm ol/L Tris-HC1(pH= 715),1mm ol/L EG T A,1mm ol/L MgC12,5mm ol/L β-巯基乙醇,10%W/V
甘油,015%CH APS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸), 011mm ol/L PMSF(苯)]，冰浴裂解30min。期间用移液器反复抽吸3次，以保证充分裂解。然后于4℃,13000转/min离心30min，吸取上层清液，用液氮快速冷冻，于-70℃保存备用。11212 PCR反应条件 每管反应液包括215μL的10×TRAP缓冲溶液(200mm ol/L tris-HC1(pH= 813),10mm ol/L EG T A,630mm ol/L K C1,0105% T ween-20,1mg/m L BS A),0113μL dNTPs(dATP, dTTP,dCTP,dG TP，各10mm ol/L),2U T aq聚合酶,3μL MgC12(25mm ol/L),011μg上游引物, 011μg下游引物(ACX或ACX M)和2μL模板，最后加水至总体积25μL。扩增条件为:30℃30min,1个循环(对细胞提取物);95℃3min,1个循环; 94℃30s,60℃30s,27个循环。
11213 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 取25μL的PCR产物，进行12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压130V)2～3h至溴酚兰染料泳带移动至凝胶前沿，电泳结束后用溴化乙锭染，于凝胶成像系统上观察并拍照。
2 结果与讨论
211 发夹型引物的工作原理
ACX M的5’-端的6个碱基与其3’-端的碱基互补，这些互补的碱基相互杂交，形成茎环结构，从而具有与分子信标5相似的发夹结构，但两端未连接任何发光基团和猝灭基团。在TRAP法的端粒酶延伸阶段
和PCR起始升温阶段(从反应混合物制制备到体系温度升至引物退火延伸温度前),ACX M处于发夹结构，此时引物的3’-端处于封闭状态，因此形成引物二聚体的可能性大为降低；当反应加热到退火延伸温度时，发夹结构打开，引物延伸才开始(见图1)。因此,ACX M在TRAP法中可起到自动热启动的作用；同时，发夹结构的存在也极大地提高了该引物的结合特异性，减少非特异结合的发生，进而有助于排除非特异性扩增产物的干扰。这与分
子信标可提高检测特异性的原理相似。
图1 发夹结构引物的工作原理
212 合成端粒酶延伸产物的检测
以浓度相同的合成端粒酶延伸产物R5、R6及R7为模板，以水为阴性参照，分别用ACX或ACX M对模板进行PCR扩增，扩增后产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳条带分析(见图2)。结果显示,
两个
图2 ACX(1～4)或ACX M(5～8)对端粒酶延伸产物扩增的电泳图
核桃楸皮
115以R5为模板 216以R6为模板 317以R7为模板 418以水为阴性对照
引物均能有效地对模板进行扩增，其中R5得到一条扩增产物条带(5p),R6得到两条扩增产物条带(56bp和62bp分别为下游引物结合在R6的27位和33位碱基处的产物),R7得到三条扩增产物条带(56bP、62bP及68bp，分别为下游引物结合在R7的27位、33位及39位碱基处的产物)4。ACX法得到的扩增产物条带上方有微弱的条带干扰，这是由
男生恋爱后患接吻病24
现代仪器二○○四年・第四期
G el electrophoresis studing hairpin structure primer on gene detection
of predictive marker for malignant tumor -telomerase activity
火龙疗法Huang Y anping 1,2 K ong Deming 1 Chai Dinggeng 1 Shen Hanxi 1 Mi Huaifeng 1(1.State K ey Laboratory of Functional P olymer Materials for Ads orption and Sep aration
Chemical School 1Nankai University ,T ianjin 300071)
(2.C ollege of Pharmacy ,T ianjin Medical University ,T ianjin 300070)
Abstract T elomerase is the m ost universal predictive marker for human cancer 1T elomerase activity has high sensitivity and specificity for diagnosis of m ost malignant tum ors 1Aiming at the specific sequence of telomersae product ,a novel primer with hairpin structure has been designed and synthesized 1It denatures to a linear structure and serves as an effec 2tive primer only at high tem perature 1Using this technology a novel method for detection of telomerase activity has been es 2tablished using nondenaturing gel electrophoresis 1It enhances the specificity of detection due to decreasing the products from non -S pecific am plification and primer dimerization 1The method has been used to detect telomerase activity in the extracts of malignant tum or cell with satis factory results 1
K ey w ords Nondenaturing gel electrophoresis P olymerase Chain Reaction (PCR ) Hairpin structure primer T elomerase activity G ene detection
于ACX 在模板上发生非专一性的退火作用，产生非特异性PCR 扩增产物导致。而ACX M 法得到较清晰的扩增产物条带。由此可见，这种利用发夹型引物的存在而完成PCR 热启动的方法，确实起到改善检测专一性的目的。213 肿瘤细胞样品中端粒酶活性的检测与常规的PCR 扩增不同,TRAP 方法检测
的不是样本中核酸的量，而是端粒酶活性。因此在PCR 扩增之前，端粒酶首先对适宜的寡核苷酸链(TS )进行延伸，产生端粒酶延伸产物。这时，若反应体系中存在有其它的线形寡核苷酸链(如下游引物)，则必然会对此延伸反应产生干扰，而ACX M 的发夹结构则排除这种干扰。实验中我们以ACX M 作为下游引物，以裂解液为阴性对照，对含不同拷贝数的H L -60细胞提取物进行了端粒酶活性检测，并与以ACX 为下游引物的检测结果进行了比较(见图3)。结果显示，对拷贝数分别为1及10
的细胞提取
图3 ACX (123)或ACX M (426)检测肿瘤细胞中端粒酶活
性的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 116以1个拷贝数为模板;215以10个拷贝数为模板;314以
裂解液为阴性对照
物，两种方法均能得到以6bp 为梯度的递增条带，说明在这两种提取物中均能检测到端粒酶的活性。而阴性对照均未出现此类条带(图3和图2的阴性对照结果不一致，这是由于引物二聚体的不确定性造成的)，说明两种方法都能避免假阳性结果的出现。比较而言,ACX M 法得到的阳性结果中电泳条带较ACX 法更为清晰，说明ACX M 法具有更高的扩增专一性，可在一定程度上改善检测灵敏度。
3 结论
本文开发一类新型的发夹型引物ACX M 。建立一种基因检测恶性肿瘤预警标志物—并将其用于端粒酶产物的PCR 反应，从而建立一种用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性的新方法。该方法操作简单，无须额外的手段即可自动实现PCR 扩增的热启动。同时还可以减少非特异性扩增产物和引物二聚体的形成，显著地提高检测方法的专一性。该法用于恶性肿瘤细胞样品中端粒酶活性的检测，取得满意的结果。
参考文献
1 M 1P 1G ranger ,W 1E 1Wright ,J 1W 1shay ,T elomerase in can 2
cer and aging ,Critical Reviews in Ontology/Hematology ,2002,41:29～402 N 1W 1K im ,M 1A 1Piatyszek ,K 1R 1Prowse et al ,S pecific as 2
s ociation of human telomerase activity with imm ortal cells and cancer ,Science ,1994,266:2011～20153 S 1N 1Saldanha ,L 1G 1Andrews ,and T 1O 1T ollefsbol ,Analysis
of telomrerase activity and detection of its catalytic subunit ,Anal 1Biochem ,2003,315;1～214 N 1W 1K im ,F 1Wu ,Advances in quantification and characteriza 2
tion of telomerase activity by the telomeric repeat am plification pro 2tocol (T R AP ),Nucleic Acids Res 1,1997,25:2595～25975 S 1T yagi ,F 1R 1K ramer ,M olecular beacons :probes that flu oresce
hy -bridization ,Nat 1Biotechn ol 1,1996,14:303～308
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流氓是怎样炼成的4二○○四年・第四期
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