原位杂交蛋白酶2清洗缓冲液
长春工程学院学报
分类号 780-4148
适应症和使用
用途
原位杂交蛋白酶2清洗缓冲液是一种肽链内切酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，是一种非特异性酶，可裂解所有的肽链。ISH蛋白酶2是一种中度活性酶，比ISH蛋白酶1活性弱，比ISH蛋白酶3强。ISH蛋白酶2用于原位杂交，用于去除其中围绕在目标DNA或RNA序列周围的蛋白。BenchMark®或Benchmark XT自动切片染机上按探针类型选择最适孵育温度和时间，避免对组织和细胞的完整性造成破坏。使用光学显微镜观察染反应。阳性结果有助于区分正常和异常标本，并作为常规组织病理学和细胞病理学的辅助指标。要合理解释任何染结果的 临床意义必须同时结合形态学观察和适当的对照。由资深的病理学家参考病人的临床病史以及其它实验室检查结果进行评估。
摘要和说明
使用原位杂交确保探针结合目标序列非常重要。切取组织切片相对容易，但在处理整个细胞甚至有机体时，必须谨记要达到目标序列必须穿过多层膜。福尔马林固定可使蛋白交联，可能阻碍探针序列到达探针目标。因此，原位杂交进程的第一阶段为酶解介导的增加膜的渗透性。
原理和操作
一般而言，原位杂交（ISH）染通过首先将标记的DNA或RNA美国制造业的衰落带来了什么启示探针与目标DNA或RNA结合，再使一抗与标记抗体结合，之后二抗与一抗结合，随后酶复合物和显底物相结合，每步之间加入清洗步骤。经酶激活的显剂在目标位点形成可见的反应产物。再对标本进行复染并盖上盖波片。使用光学显微镜读取结果，此结果有助于鉴别与特异性抗原有无关联的病理生理学过程。
原位杂交蛋白酶2清洗缓冲液用于在原位杂交进程中消除围绕目标DNA或RNA序列的蛋白。ISH蛋白酶2在很大的pH值范围内都保持活性，不容易失活。此试剂主要用于酶解组织切片，这些切片已经过常规10％中性福尔马林缓冲液固定，或用于酶解整个细胞制品，其中增加多层膜的渗透性已成为原位杂交进程中的关键步骤。BenchMark®或Benchmark XT自动切片染机上按探针类型选择最适孵育温度和时间，避免对组织和细胞的完整性造成破坏，达到最佳杂交效果。使用Ventana检测化学、探针、辅助试剂和Ventana自动切片染机最优化稀释ISH蛋白酶2。染协议的每个步骤都按精确的时间和温度进行孵育。每个孵育步骤结束时，Ventana自动切片染机清洗切片，停止反应并去除未结合的试剂，这些试剂可能妨碍后面步骤的目标反应。切片染机使用盖玻片溶液，最大程度地减少液体试剂的蒸发。有关仪器操作的详细信息，请参阅Ventana自动切片染机的“操作手册”。
材料和方法
提供的试剂
原位杂交蛋白酶2清洗缓冲液含有足够供200次试验的试剂。
1 – 20 ml的ISH蛋白酶2分配器；含有约2.5单位的碱性蛋白酶活性的氨基丁三醇溶液遥望宋朝(内含防腐剂0.01%叠氮化钠)。
使用方法
不需溶解、混合、稀释或滴定。
进一步稀释可能导致染特异性损失。使用者必须检验此类更改。
所需的材料和试剂（未提供）
以下列出了可能要用到，但本试剂盒中未提供的试剂和材料：
1. Ventana INFORM 探针
2. Ventana 阳性和阴性对照用探针
4. Ventana ISH iVIEW Blue检测试剂盒
5. Ventana ISH信号干扰消除器*
6. Ventana ISH 红复染剂
7. Ventana 反应缓冲液（10X）（使用前稀释至1X）
8. Ventana 10X SSC 溶液（使用前稀释至2 X）
9. Ventana EZ PrepTM（10X）溶液（使用前稀释至1X）
10. Ventana LCS（一种液体盖玻片溶液）
11. BenchMark 和BenchMark XT自动切片染机
纪念辛亥革命110周年讲话12. 条码标记（质控和测试中探针的相应标记）
13. 10 %中性缓冲福尔马林
14. 切片机
15. 适用于原位杂交的显微镜载片
16. 阳性和阴性质控载玻片
17. 二甲苯（组织学级）
18. 乙醇或试剂酒精（组织学级）
19. 去离子水或蒸馏水
20. 封固剂和盖玻片或自动盖片机
21. 染缸或染槽
22. 定时器
23. 光学显微镜
* 适用于特定检测。
储存和处理
储存于2-8° C。不可冰冻。对于不属于包装插页中列出的储存条件，使用者必须加以检验。
为确保正确的试剂传送和试剂盒成分的稳定性，每次运行后必须更换盖子，且必须立即将分配器垂直放置在冰箱里。每个分配器都标有有效期。如储存适当，本试剂可稳定至标记上标示的日期。一旦试剂过期，规定的储存方法将不再适用。
没有明确的迹象显示本品不稳定；因此，应将待检样本与阳性和阴性对照同时进行检测。一旦发现试剂不稳定，请立即联系您当地的 Ventana 办事处。
标本的收集和准备
常规处理、福尔马林固定、石蜡包埋组织适用于本试剂。组织切片应切割为适当的厚度才能进行正确的染。
警告和注意事项
1. 在处理试剂时应采取合理的预防措施。在处理可疑致癌物或有毒材料（如二甲苯或甲醛）时需戴上一次性手套。
2. 避免试剂接触眼睛和粘膜。如果试剂沾到敏感区域，立即用大量清水冲洗。
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3. 在处理标本或试剂的区域不得吸烟或饮食。
4. 病人样本和所有与之接触的材料都应按照生物危险材料来处理，并在处置时采取适当的预防措施。不得用嘴移液。
5. 避免试剂感染细菌，一旦感染细菌可能导致结果不准确。
6. 超出规定范围的孵育时间和温度可能得出错误的结果。使用者必须对此类更改加以检验。
7. 本试剂已经过最佳稀释，如对本品进一步稀释将造成抗原染损失。使用者必须对此类更改加以检验。
8. 过度曝光症状包括刺激皮肤和眼睛，以及刺激粘膜和上呼吸道。毒性可能通过摄食、吸入或皮肤吸收进入体内。一旦摄食会产生高量毒性。
9. 有关推荐的处置方法，请咨询地方或全国性相关机构。
使用说明
详细程序步骤
本试剂用于结合Ventana检测试剂盒、探针和配套试剂在Ventana自动切片染机上使用。可按照操作手册中列出的步骤来显示、打印和编辑自动化程序的参数。自动切片染机的其他操作参数在出厂前已经过预设置。
Ventana网络购物自动切片染机的染程序如下所示（欲了解更详细的说明和额外的协议选择，请参见操作手册）。
BenchMark或BenchMark XT自动切片染机
1. 应用载玻片条码标记，该标记对应待执行的探针协议。
2. 将ISH蛋白酶2、iVIEWBlue检测试剂盒、探针和所需的辅助试剂放到试剂托盘上，并将其放到自动切片染机上。检查试剂瓶和废物缸。
3. 将载玻片放在自动切片染机上。
4. 开始进行染。
5. 完成染后，从自动切片染机上取下载玻片。
6. 执行脱水步骤。
脱水步骤
1. 为去除盖玻片上的溶液，按顺序在2个温和的餐具洗涤剂溶液（不可使用自动洗碗机专用清洁剂）中清洗载玻片。
2. 用蒸馏水彻底冲洗载玻片约1分钟。甩去多余的水分。
3. 将载玻片放到一个80 %的酒精槽中约1分钟。
4. 将载玻片放到一个90 %的酒精槽中约1分钟。
5. 将载玻片放到第一个100 %的酒精槽中约1分钟。
6. 将载玻片放到第二个100 %的酒精槽中约1分钟。
7. 将载玻片放到第一个二甲苯槽中约30秒。
8. 将载玻片放到第二个二甲苯槽中约30秒。
9. 将盖玻片放到载玻片上。
注意：为确保彻底脱水，需要经常更换酒精槽，可能需要添加第三个100 %酒精槽。
质控程序
阳性样本对照
在执行每项染程序时必须进行阳性对照。阳性对照用来确认已应用了探针且分析仪适当地发挥了功能。这类样本可能同时包含阳性和阴性染细胞或组织成分，且可同时用作阳性和阴性对照组织。对照样本应为新鲜的剖尸、活体解剖或外科手术样本，并采用与试验切片相同的方法尽快进行制备或固定。此类样本可监控程序的所有步骤，包括从样本制备到染的各个步骤。使用与试验样本不同固定或加工方式的样本将为除固定和样本加工之外的所有试剂和方法步骤提供质控。
阳性染较弱的样本更适合优化质控和检测细微的试剂降解。
已知的阳性对照只能用于监控已加工样本和试验试剂的正确性能，而不能用来辅助检测对病人样本的特异性诊断。如果阳性对照无法证明阳性染，那么试验标本的结果应被视为无效。
阴性样本对照
可将用于阳性对照的同一个样本用于阴性对照。大部分样本中存在的各种不同的细胞类型能提供内部阴性对照位点，但使用者应对此进行检验。未经染的成分应当不出现特异性染，且显示出非特异性背景染迹象。如果阴性组织对照位点中出现特异性染，那么病人样本结果应被视为无效。
疑难解答
当对照试验有任何问题，请立即向您当地的 Ventana 办事处报告。如果对照试验缺乏特异性，那么病人结果将视为无效。详情请参见本说明书的“疑难解答”一节。在明确和解决问题后重复检测病人样本。
检测方案正确性检验
在诊断程序中初次使用探针或染分析仪之前，应先对代表已知阳性及阴性样本的已知原位杂交性能特征的一系列样本进行测试，以此检验探针的特异性（参照本说明书中的“质控程序”一节，以及美国病理家学院实验室认可体系、解剖病理检查表和NCCLS批准指南中的质控建议）。 在测定新的抗体批次时，或在更改测定参数时，应重复此类质控程序。“预期结果摘要”一节列出的样本适用于测定验证。
结果解释
Ventana自动切片染程序会产生显反应产物，从而在被标记DNA或RNA定位的靶DNA或RNA位点上出现沉淀。有关预期的显反应请参见相应的检测试剂盒的包装插页。在原位杂交程序上有经验且资深的病理学家必须在解释结果之前对阳性和阴性质控进行评估。
阳性样本对照
应首先检查已染的阳性对照，以确定所有试剂都正常发挥作用。在靶细胞内出现适当的显反应产物表示存在阳性反应。有关预期的显反应请参见所用的检测试剂盒的包装插
页。根据所用的ISH红检测试剂盒的孵育时间和效力，将以细胞的灰白至深粉显来表示复染。复染过多或不充分可能影响正确的结果解释。
如阳性样本对照无法证明阳性染，那么测试样本的任何结果应被视为无效。
病人样本
应在最后检查病人样本。应根据阴性试剂对照的任何背景染情况对阳性染强度进行评估。在原位杂交测试中如出现阴性结果表示未检测出有问题的DNA或RNA序列，而不是经测定的细胞中不存在该序列。在解释原位杂交结果时，还应结合苏木精或PAP染组织切片或细胞涂片来观察样本的形态学特征。只有综合患者样本的形态学发现及相关临床资料，病理学家才能对结果做出正确解释。
影响因素
一般影响因素
1. 原位杂交是一种多步骤诊断过程，在选择适当的试剂、样本选择、加工、原位杂交载玻片制备和染结果解释上需要进行专门的培训。
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