镍柱蛋白纯化

一、原理

镍柱里面含有琼脂糖微球体，在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与 Ni2+发生螯合，螯合后的 Ni2+能与 HIS上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离。影响蛋白质支撑作文/ 多肽与金属离子鳌合力大小的因素主要是蛋白质表面可结合的氨基酸（种类、数目和分布）、金属离子的种类和密度、层析条件（ pH 、盐的种类和浓度、添加剂等）

、缓冲液的配制（500ml PH=7.4）

Nacl 14.625g

20mM 咪唑 1.8g （5~50mM）

Nacl 可持续发展内涵	14.625g
100 mM	9g
200mM	18g
400mM咪唑	45g
600mM咪唑	63g

50ml

Elution buffer: PB

农业产业化三、操作步骤

此步骤过镍柱的所有溶液、上清蛋白都要先用滤膜过滤，所有液体过镍柱的速度要严格控制 2.5ml /min ，中间镍柱不能进气泡

1、5倍镍柱体积去离子水洗涤，去除空气和 20%乙醇 (5ml /min)

2、5~10 倍镍柱体积 Binding buffer 平衡

3、上蛋白样品

4、阻尼板5 倍镍柱体积 Wsahing buffer 洗脱杂蛋白 (HIS 标签含有 6 个组氨酸，结合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白 )，此步骤设洗脱梯度

5、5 倍镍柱体积 Elution buffer 洗脱目的蛋白，此步骤设洗脱梯度

6、5 倍体积去离子水清洗掉缓冲液

7、20%乙醇保存于 4℃

注意：洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来

四、镍柱重生 (介质使用约 3-20 次，具体与原料来源、样品体积等有关 )

1.镍柱用去离子水清洗

2.5倍镍柱体积 EDTA 重生镍柱浙江实用医学(20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA ，pH

7.4)

3.5 倍体积 Binding buffer 平衡

4.5 倍体积去离子水清洗

5.20 倍体积 1M NaoH 洗涤

6.水洗至中性

7.5 倍柱体积挂镍

8.用 5 倍体积以上的纯水清洗层析柱，去除游离的金属离子

9.20% 乙醇保存 4℃

五、注意事项

1、推荐在中性至弱碱性的条件下（ PH 7~8）结合重组蛋白，磷酸盐 Buffer 是常用的缓冲液， Tric-cl 在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度

2、避免在 pm2.5 合肥Buffer 中包含 EDTA 或柠檬酸盐等螯合剂

3、若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有 Buffer中添加 6M盐酸胍或 8M 尿素

4、避免缓冲液中有高浓度的供电子基团，如： NH4 ，甘氨酸，精氨酸， Tris

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