-论著-
含a突触核蛋白降解作用研究
穆军山，崔晓萍，周贺，王魁花，叶建新
解放军联勤保障部队第九OO医院神经內科，福建福州350025
［摘要］目的探讨miR-26抑制帕金森患者泛素-蛋白酶体系统（UPS）对含a突触核蛋白（a-Syn）降解作用。方法将120只成年雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组与模型组，每组各60只。通过1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢毗啶（MPTP）法建立帕金森病小鼠模型，采用反转录酶-聚合酶链锁反应（RT-PCR）检测模型组小鼠中脑黑质区miR-26和a-Syn的mRNA水平，并分析二者的相关性。通过1-甲基4-苯基-毗啶离子（MPP+）法建立帕金森病细胞模型,RT-PCR检测miR-26的表达水平，并转染miR-26模拟物或miR-26抑制物或加入MG132,RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测a-Syn表达水平。结果RT-PCR 检测结果显示，模型组小鼠中脑黑质区组织中miR-26、a-Syn水平均显著高于对照组，两组间比较，差异有统计学意义（P< 0.05）。模型组小鼠脑黑质区组织中miR-26水平与a-Syn的mRNA水平呈正相关（r=0.7622,P<0.05）。蛋白免疫印迹法和RT-PCR检测结果显示,SH-SY5Y细胞在转染miR-26模拟物 后,a-Syn的蛋白水平升高；转染miR-26抑制物后,a-Syn的蛋白水平降低；而转染miR-26模拟物或miR-26抑制物后,a-Syn的mRNA水平均无显著变化；加入MG132后,a-Syn蛋白水平升高,a-Syn的mRNA水平无显著变化。结论miR-26水平在帕金森病小鼠模型中上调，其不能直接调节a-Syn的表达，但能抑制UPS对a-Syn蛋白的降解。
［关键词］帕金森病；miR-26；含a突触核蛋白；泛素-蛋白酶体系
中图分类号：R742.5DOl：10.16048/j.issn.2095-5561.2021.02.10文章编号：2095-5561（2021）02-0124-04
Inhibition of miR-26on the degradation of a-Synuclein by ubiquitin-proteasome system in Parkinson's disease
MU Jun-shan,CUl Xiao-ping,ZHOU He,WANG Kui-hua,YE Jian-xin(Department of Neurology,The900th Hospital of the Joint Logistics Support Force of the Chinese People's Liberation Army，Fuzhou350025，China)
Abstract:Objective To investigate the inhibition of miR-26on the degradation of a-Synuclein(a-Syn)by the ubiquitin-proteasome system(UPS)in patients with Parkinson's disease.Methods A total of120adu
lt male C57BL/6mice were randomly divided into control group and model group,with60mice in each group.The mouse model of Parkinson's disease was established by l-methyl4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)method.The mRNA levels of miR-26and a-Syn in the substantia nigra of mice in the model group were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)，and the correlation between the two was analyzed.The cell model of Parkinson's disease was established by1-methyl-4-phenyl-pyridine ino(MPP+)method，the expression level of miR-26was detected by RT-PCR.The miR-26mimics or miR-26inhibitors were transfected or MG132was added.The expression levels of a-Syn were detected by RT-PCR and Western blot.Results The results of RT-PCR showed that the levels of miR-26and a-Syn in the substantia nigra of the midbrain of mice in the model group were significantly higher than those in the control group，and the differences between the two groups were statistically significant(P<0.05).There was a positive correlation between miR-26level and a-Syn mRNA level in the substantia nigra of mice in model group(r=0.7622,P<0.05).Western blot and RT-PCR results showed that the protein level of a-Syn in SH-SY5Y cells was increased after transfection with miR-26mimics.The protein level of a-Syn reduced after transfection with miR-26inhibitor.However，there was no significant change in the mRNA level of a-Syn after transfection with miR-26mimics or miR-26inhibitors.After adding MG132，the a-Syn protein level increased，but the a-Syn mRNA level had no significant change.Conclusion
The level of miR-26is up-regulated in the Parkinson's disease mouse model，which could not directly regulate the expression of a-Syn，but could inhibit the degradation of a-Syn by UPS.
Key words:Parkinson's disease；miR-26；a-Synuclein；Ubiquitin-proteasome system
基金项目：2017年福建省自然科学基金科技项目计划(2017J01319)帕金森病(Parkinson's disease’PD)是一种黑第一作者：穆军山(1965-)，男，山东莱州人，主任医师，硕士质纹状体区多巴胺神经元细胞丢失而导致多巴胺通信作者；叶建新，E-mail：139****9189@139
模块化建筑技术
生成障碍及Lewy小体形成为主要病理特征的进行性变性疾病［1］。PD患者的典型症状为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍等［2-5］o目前，临床上PD主要通过神经保护、手术和康复运动等方法，但效果均难以令人满意［6-7］。Lewy小体为含a突触核蛋白(a-Synuclein,a-Syn)和泛素的蛋白包涵体。其中，a-Syn是由140个氨基酸组成的小分子蛋白质，正常生理状况下呈无序结构，但PD患者的a-Syn发生突变，导致a螺旋结构被破坏，形成P折叠，从而聚集并产生具有神经毒性作用的纤维丝样蛋白聚集体⑻。有研究显示，a-Syn等异常蛋白的大量聚集和泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的功能障碍是导致PD患者神经退行性病变的主要因素⑼。miRNA 是一类小分子非编码RNA，其可通过调控基因表达参于细胞的增殖、分化、凋亡及自噬等多个生命活动，并在炎性疾病、癌症及免疫性疾病等多种疾病的发病、诊断和中发挥不同作用［10-14］。PD患者存
在多种miRNA表达量异常［15］。有研究表明，miR-26a在小鼠PD的发病中发挥重要作用［16］。但目前，关于miR-26与PD相关的研究尚未见明确定论。因此，本研究拟通过建立PD小鼠模型，探讨miR-26和a-Syn表达情况及二者的相关性，并分析miR-26对UPS的影响，旨在阐述miR-26在PD发病和进展中可能的分子机制，以期为PD的诊断和提供新的思路。现报道如下。
1材料与方法
1.1材料与试剂成年雄性C57BL/6小鼠120只，体质量25~30g，分笼饲养。所有小鼠均购自中科院动物研究所。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢毗啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)、MG132均购自国药集团；Neurobasal培养基、D-hanks液均购自美国Gibco公司；TRIzol reagent、反转录试剂盒和SYBR GREEN均购自日本TOYOBO 公司；miR-26模拟物(miR-26mimic),miR-26抑制物(miR-26inhibitor)、Lipo2000转染试剂盒、加尾法miRNA cDNA第1链合成试剂盒和miRNA荧光定量PCR检测试剂盒均购自美国Sigma-Aldrich公司；抗a-Syn抗体和兔抗人抗体均购自英国Abeam公司。SH-SY5Y细胞购自北纳生物。
1.2细胞培养及转染将SH-SY5Y细胞接种至6孔板中，加入2ml RPMI1640培养基及青霉素、链霉素，于含5%CO2的37T恒温培养箱中培养。细胞密度约60%且状态良好时，更换新鲜培养基，用无菌磷酸盐缓冲液配制1-甲基-4-苯基-毗啶离子(1-methyl-4-phenyl-pyridine ion，MPP+)溶液，调至浓度为1mm
ol/L后，加入到细胞中，继续培养24h，建立PD细胞模型。培养24h后，加入到细胞中，分别转染miR-26mimic、miR-26inhibitor或加入MG132。培养6h后，更换新鲜的培养基，再继续培养24h后，收获细胞备用。
1.3PD病小鼠模型的建立将120只小鼠随机分为对照组和模型组，每组各60只。模型组小鼠腹腔注射MPTT溶液20mg/kg，每日1次；对照组小鼠腹腔注射无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)20mg/kg，每日1次。所有小鼠在连续注射后5d后处死，提取中脑黑质区组织备用。
1.4反转录酶-聚合酶链锁反应检测a-Syn mRNA 的表达水平模型组和对照组小鼠中脑黑质区组织用液氮研磨制成单细胞悬液。将SH-SY5Y细胞及两组小鼠脑黑质区组织研磨成的单细胞悬液分别用Trizol法抽提总RNA，分光光度法进行定量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。用反转录试剂盒获得cDNA，根据SYBR GREEN试剂盒进行反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-poly-merase chain reaction，RT-PCR)检测。其中，miR-26的RNA提取用小RNA提取试剂盒；cDNA的获得用加尾法miRNA cDNA第1链合成试剂盒；检测用miRNA荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain re-action,PCR)检测试剂盒。用20法分析数据。引物设计由上海英骏生物技术有限公司合成。见表1。
表1RT-PCR引物信息表
基因名称上/下游引物序列Tm/t
Pf-5'-GCCCGCAAGAACCAGGAAGG-3'
miR-2661.3
Pr：5'-GTGCGAATACCTCGGACCCT-3'
「Pf：5'-GAGTTGTGGCTGCTGCTGAG-3'“小
a-Syn59.0
Pr：5'-GGGCTCCTTCTTCATTCTTG-3'
Pf：5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'
GAP DH58.2
tdc
Pr：5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'
1.5蛋白免疫印迹法检测蛋白酶体的表达收获SH-SY5Y细胞，用SDS loading buffer处理蛋白样品后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转至PVDF膜, 5%牛血白蛋白(bovine serum albumin,BSA)于4t 封闭过夜，洗涤后37t敷一抗(抗a-Syn抗体)1h,
再洗涤3次，于37T 敷二抗（兔抗人抗体）30 min,
洗涤后显影。
1. 6统计学方法 采用Graphpad prism 6对数据
北京女奴进行分析。计量资料以均数土标准差（"土 s ）表示, 两组间比较采用t 检验，相关性分析采用Pearson 相 关分析。以P <0. 05为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 PD 小鼠模型中miR-26上调并与a-Syn 呈帀
相关RT-PCR 检测结果显示，模型组小鼠中脑黑
质区组织中miR-26、a-Syn 水平均显著高于对照组, 两组间比较，差异有统计学意义（P <0.05）。见
图 1。模型组小鼠脑黑质区组织中 miR-26 水平与 a-Syn 的mRNA 水平呈正相关（r = 0. 762 2 , P <
0.05）。这表明，在PD 小鼠模型中，miR-26和 a-Syn 的表达均上调，且二者的水平呈正相关，即 miR-26 可能促进 a-Syn 的表达。 见图 2。
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图1 RT-PCR 检测PD 小鼠模型脑黑质区组织中miR-26、a-Syn 的表达情况（a. miR-26；b. a-Syn ）图2 PD 小鼠模型
脑黑质区组织中miR-26,a-Syn 表达的相关性
2.2 PD 病细胞模型中miR-26抑制UPS 对a-Syn 的
降解蛋白免疫印迹法和RT-PCR 检测结果显示， SH-SY5Y 细胞在转染miR-26 mimic 后，a-Syn 的蛋
白水平升高；转染miR-26 inhibitor 后,a-Syn 的蛋白
水平降低；而转染 miR-26 mimic 或 miR-26 inhibitor
后,a-Syn 的mRNA 水平均无显著变化；加入 MG132后,a-Syn 蛋白水平升高,a-Syn 的mRNA 水
平无显著变化。这表明，miR-26不直接调节a-Syn
的mRNA 或蛋白表达水平，而是起到与MG132类似的
作用。即抑制UPS 对a-Syn 的降解。见图3 ~4。
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图3 RT-PCR 检测PD 小鼠模型脑黑质区组织中miR-26、a-Syn 的mRNA 水平（a. miR-26；b. a-Syn ） 图4 蛋白免疫 印迹法检测PD 小鼠模型脑黑质区组织中a-Syn 的蛋白水平
3讨论
PD 是一种严重影响老年人身心健康和生活质
量的疾病［17］。其典型的病理改变是多巴胺生成障
碍及Lewy 小体形成，其中,Lewy 小体的主要成分是
a-Syn,PD 患者的a-Syn 发生突变，可对多巴胺能神
经元有选择性神经毒性作用［18］o 本研究通过建立
PD 小鼠模型，检测模型小鼠中脑黑质部分中 miR-26和a-Syn 的水平。结果发现，模型小鼠中
miR-26和a-Syn 的水平均显著高于对照组小鼠，且
二者的水平呈正相关。这表明,miR-26可能通过某
种方式促进a-Syn 的表达，因此，需要通过进一步 的细胞实验予以验证。PD 的动物模型主要有两大
类，分别是通过神经毒素诱导多巴胺能神经元变性
和模拟PD 神经递质缺失［19］o 本研究选取MPTP 建
立小鼠模型属于第一类，效果稳定，模型动物的症状和 病理改变亦比较接近人类，结果比较可靠。
本研究通过MPP +法获得PD 细胞模型，并通 过转染miR-26模拟物或miR-26抑制物以验证
miR-26是否能直接调控a-Syn的表达。结果显示，转染miR-26mimic或miR-26inhibitor后，细胞中a-Syn的mRNA表达无显著变化。这表明,miR-26并不能在mRNA水平上直接调控a-Syn的表达。而转染miR-26mimic后,a-Syn的蛋白水平增加，转染miR-26inhibitor后a-Syn的蛋白水平降低，这种效果与UPS的抑制剂MG132完全相同。MG132是UPS的抑制物，只能抑制UPS对a-Syn蛋白的降解，不能影响a-Syn的mRNA水平[20]。这表明，miR-26可能起到与MG132类似的作用，抑制UPS 对a-Syn蛋白的降解，其可能与UPS中的某个蛋白具有相关性，可能通过调节该蛋白以抑制UPS的功能。有研究显示，TWIST1/miR-199/214可促进UPS的活性上调[21],miR-7可调节细胞自噬并促进UPS的功能[22]O这与本研究有相符之处。
综上所述，miR-26水平在PD小鼠模型中上调，并与a-Syn的水平呈正相关，在PD细胞模型中发现miR-26并不能直接调节a-Syn的mRNA的表达水平，仅能抑制UPS对a-Syn蛋白的降解。今后，可通过不同的动物模型和细胞模型以及PD患者的临床标本以验证该结论，并通过分子生物学实验确定miR-26的靶蛋白，进一步研究miR-26抑制UPS功能的分子机制，以期阐明miR-26在PD中的作用，为PD发病机制的研究提供新的方向。
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(收稿日期：2020-12-28)
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