包涵体表达技巧之一——快速增值和收获包涵体陈吉龙是怎么回事
关于包涵体蛋白表达，大肠杆菌菌种BL21（DE3亚型），质粒PET41，双抗（质粒携带两种抗生素），内藏目标蛋白X。 牛牛菌种的获取：100ml LB液体培养基，加入2-5倍于常规的抗生素量，再1：50加入已经转入质粒的菌种，220 rpm 37度，转啊转，转法是，选择底部有凹凸的瓶子，或者把你的瓶子倾斜（水平夹角约70度），目的是保证转的过程中培养基溶解大量空气进去（有泡沫为证），我发誓，它们喜欢这个。当培养基的OD600达到0.5或略低于0.5（摇之前做好对照啊），收菌，做成含30%-50%甘油的储备菌，-80保存。这种菌，由于培养基抗生素含量高，所以都是“摔打”出来的，而且还处在对数期，为年轻一代，故称牛牛菌种。选一个无聊的上午接菌，晚饭前就有甘油菌了。 表达开始在一个慵懒的上午，早上8、9点，手持你的甘油菌快速解冻，1：100加到100ml 含有正常量抗生素的LB液体培养基中（不用超标加抗生素了），220 rpm 37度，注意还是要溶解很多空气进去，保证它们喜欢。
2个到2个半小时后，也就是11点左右，把你唤醒的菌种1：100接到你的大瓶培养基中（常规抗生素含量），此时你的牛牛菌依旧年轻奔放而活力四射，依旧220 rpm 37度，保证要有大量泡沫，然后你可以去吃饭和睡午觉了，当然，别忘了把诱导剂拿出来放在4度化冻。
2小时或2个半小时后，也就是1点到2点之间，你的菌液OD600已经可以达到了0.5-0.6了，此时加入诱导剂，比如IPTG，诱导3小时，依旧是快摇，保证有大量泡沫，哦，诱导时盖子要有缝隙，保证外界空气能进去。放心，有抗生素和优势菌在，外面的菌进去活不长。
5点到5点半，收菌，4度10000 G 离心10 min，弃上清得到沉淀。
此时你有几种选择，第一，把菌冻起来回家吃晚饭，一切明天再说；第二，吃完晚饭过来，不嫌麻烦的话用预冷的PBS重悬菌，再离心以去除某些杂质（反正我是不做这一步的）；第三，把装菌的离心管扔到液氮里，再拿出来室温化冻，加入你用的裂解液（根据Novagen的建议），然后放到摇床上200 rpm 摇10 min，裂解液就可以把菌块全化了。
如果你迫不得已或者打算餐后做消食运动，可以进行菌液的裂解。要不然就留给明天吧。
midd在这里强烈推荐Novagen的BugBuster Mix，很好用，参照它的说明就可完成裂解。不足之处是贵了点。
Lysis A 裂解液配方：50 mM Tris.Cl，5 mM EDTA，150 mM NaCl，0.5% TritonX100，0.5%去氧胆酸钠，pH 8.0 （这个配方也许源于分子克隆，但是自己想当然配的，
没看分子克隆）。
Lysis B 裂解液配方：50 mM Tris.Cl，150 mM NaCl，0.5% TritonX100，pH 8.0。
Lysis A 一般是1g湿菌加入10-20ml 裂解。
此时你有两个选择，第一，超声波破碎菌体（我从不玩机械破碎）；第二，加入终浓度25-30 U/ml 的Benzonase和终浓度为1KU/ml 的rLysozyme，37度摇床30min。实际上，我经常画蛇添足地先超声再加酶摇。
4度16000 G 15 min，得到沉淀。
重悬沉淀用Lysis B，无论你想用涡旋还是吸管吹，都没问题，加多少LysisB 也没影响，只要能悬散就行，如果不放心，还可以加入rLysozyme或者Benzonase，浓度同上，室温或37度晃荡10min。
为何用Lysis B？嗯，如果你的下游实验是IMAC，大概不希望EDTA螯合你的柱子上的金属离子，而且，剔除作为阳离子去污剂的去氧胆酸钠也没什么坏处。当然，可以用无EDTA的蛋白酶抑制剂替代EDTA，然后不加去氧胆酸钠，那么你就只需要一种类似于BugBuster的裂解液了。当然，我不知道BugBuster的配方，也不想另加蛋白酶抑制剂。 用重悬后的沉淀可以10000 G离心10min后再用LysisB重悬，这个步骤可以做3次，然后用PBS重悬一次（PBS量可以大一点，以充分稀释TritonX100），16000 G 15 min，得到的就是包涵体了。
到这里可以冻上，也可以加进变性液变性，无论6M盐酸胍或8M尿素，带上0.2M 磷酸盐或者参照分子克隆配方，但保证pH8.0为宜。感觉变性液吹不散包涵体的话，可以超声（大功率、间歇）打散包涵体，放心，三四百瓦特的功率打不碎蛋白，只会打烂核酸。你可以让它37度摇1小时到3小时，或者室温、4度之类过夜，有变性剂在，你的蛋白很安全。
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被几位斑竹“埋汰”说每次写的东西太长，没谁有耐性看，所以只好写成一个个标题，望谅解。
以Ni柱结合His为例，市售Sepharose柱子或者NTA都行，差别是，NTA有更多的金属离子结合位点，理论上说能结合更多蛋白，而且NTA能承受的压力上限要高一些。这里的重折叠过程不太适合超滤的步骤，仅针对IMAC。 柱子结合Ni可参照说明书，结合后，建议将水洗过程换成复性液洗涤，复性液配方为：8M尿素或者6M盐酸胍，0.2M醋酸，pH4.0。酸性条件不利于蛋白上柱，所以洗一次就行，剔除结合未稳的Ni和柱子表面可能有的杂质，然后加入
你用的变性液洗涤平衡柱子，使柱子适应pH8.0的环境。不过千万别总把柱子泡在变性液里。
扶绥中学加入变性好的蛋白溶液，室温1小时振荡结合即可，不要太剧烈，保证柱子不沉下去就行。
我们在使用超滤时，往往无法避免蛋白在重折叠过程中发生聚集的情况，所以加入DTT以防止S-S的形成。而对于上柱的蛋白，优势在于，可以直接在柱子上重折叠，而不必担心蛋白间形成聚集沉淀，缺点就是不能大量生产。
以机器纯化为例，使用FPLC或者AKTA。
合成化学变性液（A），重折叠液（B），重折叠液即为剔除了变性剂的A。
N种方案，捡几种来说。
A液为起始100%，B液为终末100%，逐渐用B液完全替代A液，对20ml 以内Ni柱，设总体积300毫升洗涤，流量为0.8ml/min，压力上限对NTA为0.5，对Sepharose为0.3，其实实际运行中很少超过0.1。
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在开始你会看到屏幕上UV值暴涨，那是因为很多未结合和结合不稳的蛋白被洗脱，里面有目标蛋白也有杂蛋白，不用管，1小时后UV值就会下降到一个恒定值。这个过程会持续约6小时，随后可以看到B液浓度开始走水平，表明过柱的已经是100%的B液了。不要急着收，让其再运行30min。这时目标蛋白就完成了重折叠。可以参考常规洗脱办法了。
注意在这个方法中，不含有任何还原剂，如DTT或2巯基乙醇或者还原型谷胱甘肽，仅有变性液含有变性剂，仅有洗脱液含有咪唑（500mM），全部剔除甘油。所需液体仅三种：变性液、重折叠液、洗脱液。如果觉得配置6M盐酸胍或8M 尿素是一种痛苦，以上步骤不失是一种简单实用的技术。当然，整个过程最好在4度，最起码也得用冰水不间断流过柱子外围，保证纯化的蛋白具有活性。一般认为，8M尿素在4度会析出结晶，所以推荐6M盐酸胍，实际上，由于整个过程液体都在流动，8M尿素不会析出，它仅仅比盐酸胍在静止状态下容易析出，两者析出特点的区别仅仅在于尿素在4度会更短时间就析出，而盐酸胍花的时间更长。
两个建议：
一、重折叠液可以是pH8.0，也可以是pH6.0这样的酸性，根据你的蛋白最后要的工作条件。如果你的蛋白需要在弱酸性条件或中性条件下工作，建议将重折叠液调为pH6.0，然后洗脱液和透析液也是pH6.0。如果重折叠液是pH8.0，洗脱液是pH6.0，一些天生具有聚集特性的蛋白可能在透析时发生小范围聚集，但会让人很不爽。pH6.0的重折叠液也有缺点，就是蛋白容易在重折叠过程中损失一些，因为弱酸性条件并不利于His挂Ni柱，但这个损失很少，相反可以洗掉很多非特异蛋白。有一些老式步骤中使用低浓度咪唑（比如10 mM）来剔除非特异结
合，结果是一样的。
二、这个重折叠可以设定为总量400ml，流速0.5ml/min，那么晚饭后做上就可以回家睡大觉了，第二天早上再来洗脱，不过确保过夜的液体得够啊。
包涵体表达技巧之三——手工玩重折叠
先声明，关于这些技术，我数年来参考了很多方案，后来自己摸出了此步骤，如果有类似的方法已经见诸文献，纯属巧合，呵呵。
手动步骤是无法使用机器的下策。
所有液体配方同机器纯化方案，但重折叠过程略作修改。
A液洗涤数次，直到你感觉行了，一般是3-5次，每次5倍柱体积，洗涤过程最好是4度摇床缓慢振荡，以不使柱子沉淀的强度为宜，每次2min足矣。每次洗了都要低速离心（1000 G 5min），弃上清。
设N个梯度，每个5倍柱体积，A:B体积比分别为：10/0，9/1，1/9，0/10。依次洗下来以使B液缓慢替代A液。每次洗同样是4度轻振荡2min，5倍柱体积，然后低速离心弃上清。最后还要用100%的B液洗两次，保证干净
关于pH值，与机器洗涤方法同样。
一些额外的建议：
一、以His标签为例，如果你感觉6x His标签会影响下游试验，那么分析你的蛋白序列，如果自带10个以上His，不妨在构建质粒时选没有标签的载体，一样可以很好结合，只是要保证手动洗涤时不会剧烈振荡。如果你担心蛋白自身的His 结合柱子之后会影响重折叠，实际上要是带了His标签的蛋白也是无法保证结合柱子的都是标签的蛋白，而且根据我手上的FTIR结果，利用蛋白自身的His结合后得到的重折叠蛋白依旧是类似天然构象。
二、如果无法保证在4度完成重折叠和洗脱过程，那么就按原始方案保留A、B 液和洗脱液中的甘油。不过透析液中最好不要有甘油。
三、透析之前，务必清楚自己的透析袋的MWCO值，别把目标蛋白透出去了。以上步骤得到的蛋白透析过程相对简单，加进100倍蛋白体积的透析液，4度透析1-3小时，再换100倍体积新透析液透析4小时或者过夜就行了。如果不放心里面的咪唑，还可以多透一两次。
强调：透析液最好不要是dd水，而是缓冲液。可以根据自己的下游实验自行设计透析液。但是最好不要带有下游实验反应缓冲液中不存在的成分。比如，你的下游试验如果是蛋白相互作用，而缓冲液不含钾离子，那么透析液也就不要含钾离子。
该方法同样适用于GST之类标签的需要重折叠的蛋白。透析后的蛋白若感觉浓度不够可以用超滤管浓缩，同样务必注意超滤管的
包涵体表达技巧之四——柱回收与再利用
勤俭持家是中华民族的传统美德，如果你想节约自己的柱子，就和胖胖一起玩柱子回收吧。
以市售Sepharose（常用的所谓Fast Flow）和NTA柱子为例。
洗脱蛋白后的柱子，实际上还是很脏，N多杂质在上面，还有很多目标蛋白，算了，洗不下来就忍了。
步骤：
10倍柱体积0.5M NaOH洗柱1次，弃上清；
10倍柱体积水洗1-2次；
5倍体积复性液（6M盐酸胍或8M尿素，0.2M 醋酸，pH4.0）洗柱一次。PS：一般NaOH洗后有棕沉淀，而复性液洗后有白沉淀，都是乱七八糟的蛋白——实际上，pH4.0条件会让蛋白掉下来，推
理到纯化过程的洗脱一步，如果你不想用咪唑置换His，那不妨用pH4.0的洗脱液，如果你的蛋白不怕酸的话。
10倍柱体积水洗1-2次；
到这里，你的柱子可以再经20%乙醇或0.5M NaOH洗一次，就可保存到相应的保护液里面了。如果柱子已经经历了3次蛋白纯化，那么可继续进行下面步骤。
水洗后的柱子加入2倍柱体积0.2%SDS洗1次；
10倍体积水洗1次以去除SDS；
2倍体积25%乙醇洗1次；
2倍体积50%乙醇洗1次；
2倍体积75%乙醇洗1次；
5倍体积100%乙醇洗1次；
2倍体积75%乙醇洗1次；
2倍体积50%乙醇洗1次；gn205
2倍体积25%乙醇洗1次；
10倍体积水洗1次；
5倍体积100 mM EDTA洗1次，这时柱子应该恢复成白，因为金属离子被螯合了。
10倍体积水洗1-2次，完全去掉EDTA；
加入你用的金属离子重新结合柱子，室温1小时够了；
10倍体积水洗1次，以去掉没结合的金属离子；
5倍体积复性液洗1次；
到这里，再用你柱子保存液洗柱1次就可以把柱子保存起来了。
到了该让蛋白结合柱子的时候，可以再拿复性液洗1次，然后变性液洗1-2次，让柱子适应了pH8.0的变性环境，就可以加入蛋白变性后的溶液了。
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