动物医学进展,021,42(4)=39-43
Progress in Veterinary Medicine
刘丽萍，火兴民，谢飞，张旺东，吴秀萍，李瑞，陆佳，王雯慧*
（甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070）
摘要：为制备抗双峰驼FcRn的抗体，首先从NCEI收录的双峰驼FCGRT基因序列中选取编码区，经跨膜结构和信号肽预测分析，截取不含信号肽的膜外序列并构建重组质粒p ET-28a-FcRn，然后在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中用IPTG诱导表达及表达条件优化，用纯化后的FcRn重组蛋白免疫家兔，制备抗双峰驼FcRn的多克隆抗体，并通过间接ELISA和Western blot检测效价及其特异性。结果表明，获得的FcRn 重组蛋白与预期大小一致（34ku），且以包涵体形式表达，其最佳IPTG诱导浓度为0.3mmol/L，诱导时间为6h。ELISA检测抗体效价为1:32000,Western blot鉴定该抗体能与重组蛋白发生特异性结合。说明已成功制备了高效价和特异性良好的兔抗双峰驼FcRn多克隆抗体。 关键词：双峰驼;FCGRT基因；FcRn重组蛋白；原核表达；多克隆抗体
文献标识码：A文章编号：007-5038（2021）0，1-0039-05
新生动物Fc受体（FcRn）是一种跨膜型的异质二聚体糖蛋白，由一条重链（a链）与一条可溶性的轻链（链）P2-微球蛋白,2m）以非共价键连接组成［］。FcRn重链由FCGRT基因编码，由3个胞外结构域（a1、a2和a3）、1个跨膜结构域和1个由44个氨基酸组成的细胞质尾部构成⑵。虽然FcRn与组织相容性复合体（MHC）I在结构上高度相似，但由于其狭窄的抗原结合凹槽而不能与抗原肽结合［,］。FcRn结合配体IgG和白蛋白具有pH依赖性，即在低pH（pH<6.5）时能与它们的Fc区域结合，而在生理pH（7.3〜7.4）下将其释放4，从而保护IgG和白蛋白免受细胞内溶酶体的降解，延长它们在血液循环中的半衰期［56。在缺乏FcRn的小鼠中，IgG和白蛋白的半衰期均缩短至约1d，意味着IgG的半衰期缩短了4倍〜5倍，并且白蛋白的半衰期缩短了15倍〜2倍3。在动物模型中FcRn 的缺乏会导致血浆中IgG浓度和对自身免疫性疾病的抵抗力均降低7。FcRn首次被发现在啮齿类动物中作为转运母体IgGs跨越新生儿肠黏膜的受体，其表达具有物种、年龄及组织细胞差异性。如FcRn 在人类胎儿和成人肠上皮细胞中均可高度表达8，但在啮齿类动物中，FcRn仅在新生儿的小肠近端肠上皮细胞中高度表达，断奶后其表达水平急剧下降⑵，而在成年鼠中表达量不高9。FcRn在所有物种的肺泡巨噬细胞中均可高度表达，但在造血细胞系中，FcRn的表达仅限于髓细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞［］。作为一种抗体转运体，FcRn通过携带母体IgG穿过胎盘合胞体滋养层、呼吸道、肠道和生殖道的极化上皮细胞从而建立被动免疫［0］。FcRn也是提供药物、和疫苗的一个目标［1。总之,FcRn在建立早期新生儿免疫中起关键作用，并参与自然感染和疫苗接种的免疫反应。
本课题组已成功制备出双峰驼IgA、IgM、IgE 多克隆抗体，并研究了其在双峰驼腭扁桃体的分布特征［12-13］；从血清中分离出双峰驼IgG抗体并研究其在小肠中的分布特征。本试验首先合成双峰驼FCGRT基因序列并构建重组质粒，然后原核表达及优化表达条件，最后用纯化后的重组蛋白免疫家兔，制备兔抗双峰驼FcRn多克隆抗体，并通过间接ELISA和Western blot.检测效价及特异性，为双峰驼黏膜免疫的深入研究奠定基础。
1材料与方法
1.材料
1.1.实验动物新西兰大白兔，雄性，体重约
2.3 kg，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。
1.12主要试剂载体pET28a（+）、感受态细胞BI2KDE3）,Solarbio生物科技有限公司产品；His 标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）康为世纪生物
收稿日期：2020-03-23
基金项目：国家自然科学基金项目（31960693,31760723）
作者简介：刘丽萍（1991—），女，甘肃兰州人，硕士研究生，主要从事动物黏膜免疫学与黏膜免疫病理学研究。*通讯作者
40动物医学进展2021年第42卷第4期（总第334期）
科技有限公司产品；HRP标记的山羊抗兔IgG, BOSTER生物工程有限公司产品；双峰驼FcRn重组蛋白，甘肃农业大学动物医学院病理实验室制备。
1.1.3主要仪器紫外分光光度仪，美国GE公司产品；超声波细胞破碎仪，浙江宁波新芝生物科技股份有限公司产品；全波长酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司产品.
II方法
I.2.1双峰驼FCGRT基因的合成与重组质粒的构建首先参照NCEI收录的双峰驼FcRn基因序列（GenBank accession no.XM-010946978.1），选取编码区（CDs），经DNA STAR和TMHMM Server2.0软件进行FcRn蛋白抗原表位和跨膜结构预测，截取膜外部分；然后利用SignalP4.1Server软件进行FcRn蛋白信号肽预测，截除信号肽部分后，在碱基序列的上游和下游分别添加起始密码子ATG和终止密码子TAG；接着，用Primer5进行酶切位点预测，添加酶切位点BamH I和Xho I；最终，将截取的FcRn进行碱基优化后送金唯智生物科技有限公司合成，并与pET28a（+）载体连接后转化进DH5a 感受态细胞，提取质粒经测序分析，将测序正确的阳性重组质粒命名为pET-28a-FcRn0
III p ET-28a-FcRn重组质粒在大肠埃希氏菌中的诱导表达及表达形式将公司构建的pET-28a-FcRn重组质粒转入感受态细胞EL21（ED3）中，挑取单个菌落于灭菌的LB液体培养基中（Kan）, 37°C培养至OD600nm值达到0.6~0.8时，用1.0 mmol/L的IPTG诱导6h后收集菌体，置于一80°C 反复冻融3次，超声破碎至液体清亮为止（约40 min），分别收集上清和沉淀°最终，将所有的样品进行SDS-PAGE检测。
II.3双峰驼FcRn重组蛋白表达条件优化与纯化为了提高FcRn重组蛋白的表达量，分别采用不同IPTG浓度（0.1、01、01、01、0.9、11mmol/L）和不同诱导时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h）进行优化表达，然后进行SDS-PAGE检测。在最优条件下，大批量表达FcRn重组蛋白，超声破碎菌体，依据His标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）中的操作步骤纯化目的蛋白，用SDS-PAGE检测，紫外分光光度仪测定蛋白含量.
111双峰驼FcRn多克隆抗体的制备将家兔适应性饲喂1周后，从耳缘静脉采集血液并收集血清.将纯化后的重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化后，按照800“g/只的剂量采用背部皮下多点注射方式免疫家兔.1周后将纯化后重组蛋白与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化，以400“g/只的剂量在肩胛部及腘淋巴结多点注射.之后每间隔1周加强免疫1次（方法和剂量同第2次）。待第4次免疫6d后，心脏采集血液，获得兔抗双峰驼FcRn的多抗血清.
11.5双峰驼FcRn多克隆抗体血清效价的检测
将纯化的FcRn重组蛋白作为抗原，以5“g/孔的量4C过夜包被酶标板，经洗涤、封闭、洗涤后，加入按1:2000—1:128000梯度稀释的血清，37°C孵育1h，洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1:8000稀释），37°C孵育1h，再次洗涤后在避光条件下加入TMB底物显液，显15min后加入2mol/L的H2SO,t终止反应（50“L/孔），最后，用酶标仪测定450 nm处的吸光值（OD）。以OD待测/OD阴性>2.1的最 高稀释倍数作为该多抗血清的效价。
11.6双峰驼FcRn多克隆抗体的Western blot.分析将纯化后的FcRn重组蛋白经常规120g/L SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜上，然后放至含50g/L脱脂奶粉的TBS-T中，37°C封闭2h后，分别用免疫前兔血清和兔抗血清为一抗（1:500稀释），4°C孵育过夜；经TBS-T洗涤3次，用HRP标记的山羊抗兔IgG（1:8000稀释）室温孵育2h，再经TBS-T洗涤3次后，滴加ECL发光液进行显。2结果
2.1双峰驼FCGRT基因合成与重组质粒构建的结果
通过对双峰驼FcRn蛋白亲水性（图1A）和抗原表位（图1E）的预测分析，表明该蛋白为抗原指数较高的疏水性蛋白；跨膜结构预测FcRn蛋白总共有355个氨基酸，其中氨基酸1299为膜外区（图2），利用Editseq（DNASTAR7.0）截取膜外部分；信号肽预测该蛋白氨基酸124为信号肽部分（图3），截除信号肽，剩余275个氨基酸，然后在上游和下游分别添加起始密码子ATG和终止密码子TAG，最终预测该FcRn重组蛋白大小为34ku。
21pET-28a-FcRn重组质粒在大肠埃希氏菌中诱导表达及表达形式
将重组菌37C培养至OD600nm值为0.8时，用IPTG（1.0mmol/L）诱导6h后收集菌体，超声破碎后分别收集上清和沉淀，经SDS-PAGE检测重组菌诱导后产物与重组菌诱导前产物相比出现了明显的表达条带（图4）；超声破碎离心后，目的条带只出现在重组菌诱导产物的沉淀中，说明重组蛋白FcRn 在BL21中成功表达，且以包涵体的形式存在，其大小约为34ku，与预期相符.
刘丽萍等：双峰驼FCGRT 基因的原核表达及多克隆抗体的制备41
图1双峰驼FcRn 蛋白亲水性与抗原表位的预测
M 1 2 3 4 5 6
Fig. 1
Prediction of the hydrophilicity and epitope of FcRn protein in Bactrian camel
图2 双峰驼FcRn 蛋白跨膜区的预测
Fig.2 Prediction of FcRn protein transmembrane region
in Bactrian camel
SignalP-4.1 prediction (euk networks): 1
n
C-score -----S-score -----'Y-score -----
/
.IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
MRVPHSQPWGLAL LL LL L PGTLRAAE SHHSLLYHFTAVSNPASGT PA FWVSGWLGPQQYLSYNNLRAQA f
0 10 20 30 40 50 60 70
图3 双峰驼FcRn 蛋白信号肽的预测
Fig.3 Prediction of FcRn protein signal peptide in Bactrian camel
2.3 双峰驼FcRn 重组蛋白表达条件优化和纯化 结果
对重组菌以不同浓度的IPTG 进行诱导表达,
SDS-PAGE 检测在此IPTG 浓度梯度范围内（0.1
mmol/L 〜10 mmol/L ） IPTG 的诱导作用不是很
明显，但相比而言，在IPTG 浓度为0.3 mmol/L 时，蛋白表达量最多（图5）故FcRn 重组蛋白表达
的最佳IPTG 诱导浓度为0.3 mmol/L 。
对重组菌以不同的时间进行诱导表达（1 h~
10 h ）SDS-PAGE 检测在添加 0.3 mmol/L IPTG
foxy电脑迷
诱导1 h 时，就有目的蛋白表达，随着时间的推移, 表达量逐渐增加,6 h 时目的蛋白的表达量达到了 最高（图6），故FcRn 重组蛋白表达的最佳诱导时间
为6h 。
M.蛋白分子质量标准；1重组菌诱导前产物；〜3.重组菌诱导后产
物；4.重组菌诱导产物的上清；.重组菌诱导产物的沉淀；.纯化后 的重组蛋白
M.Protein molecular weight Marker ； 1. Recombinant bacteria pre-in duction products ； 2-3. Recombinant bacteria induced products ； 4. Su pernatant of recombinant bacteria induced products ; 5.Precipitate of
recombinant bacteria induced products ； 6.Purifed recombinant pro tein
图4 双峰驼FcRn 重组蛋白表达的SDS-PAGE 检测
Fig.4 SDS-PAGE detection of FcRn recombinant protein
expression in Bactrian camel
M.蛋白分子质量标准；1.重组菌诱导前产物；2〜7.0.1、0.3、0.5、0.7、
0.9.10 mmol/L 的IPTG 浓度诱导的重组菌产物
M.Protein molecular weight Marker ； 1. Recombinant bacteria pre-in duction products ； 2-7. The recombinant products induced by IPTG concentration of 0.1,0.3,0.5,0.7,0.9,1.0 mmol/L
图5 双峰驼FcRn 重组蛋白IPTG 诱导浓度的优化
Fig.5 The optimization of IPTG concentration of
FcRn recombinant protein in Bactrian camel
2.4双峰驼FcRn 重组蛋白的纯化结果
以最佳表达条件大批量表达FcRn 重组蛋白,
纯化时收集洗脱液，经紫外分光光度仪测定其最高 蛋白含量为2.544 mg/mL, SDS-PAGE 检测纯化后
的重组蛋白纯度高，无杂蛋白，大小为34 ku （图7）铁皮石斛组培
。
42动物医学进展2021年第42卷第4期（总第334期）
2.5双峰驼FcRn多克隆抗体血清效价的ELISA
检测结果
用间接ELISA测定抗体效价，将抗血清与免疫
前阴性血清分别以1:32000和1：2000稀释时,
OD450nm（阳性）/OD450nm（阴性）＞2.1，说明
该抗体血清效价为1:32000。
10ku-M1234567891011
180ku->
100ku->
舅詩
35ku->
25ku—►
15ku—►詹姆斯 罗伯特
M.蛋白分子质量标准；1.重组菌诱导前产物；2-11.重组菌被诱导1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h的产物
M.Protein molecular weight Marker；1.Recombinant bacteria pre-induction products;2-11.Products of recombinant bacteria induced for 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10h
图6双峰驼FcRn重组蛋白表达时间的优化
Fig.6The optimization of expression time of
FcRn recombinant protein in Bactrian camel
M.蛋白分子质量标准；1〜4.纯化后的重组蛋白
M.Protein molecular weight Marker；1-4.Purifed recombinant protein
图7双峰驼FcRn重组蛋白的纯化结果Fig.7Purification of Bactrian camel FcRn recombinant protein 2.6双峰驼FcRn多克隆抗体的Western blot.鉴定结果
Western blot鉴定在膜上约34ku处有明显的蛋白印迹出现（图8）说明该兔抗双峰驼FcRn抗体能与重组蛋白特异性结合，即具有反应原性.
12
十34ku
1.免疫前兔血清；
2.兔抗血清
1.Rabbit serum before immunization；
2.Rabbit antiserum
图8双峰驼FcRn多克隆抗体的Western blotting鉴定结果Fig.8Western blot results of polyclonal antibody
against FcRn in Bactrian camel
3讨论
双峰驼作为中国西北及华北荒漠、半荒漠地区特有的经济畜种之一，常年生活于干旱多沙和气温起伏很大的沙漠环境中，其怀孕周期（13个月）和产羔间隔（至少2年以上）长，母驼初配年龄在4岁〜5岁，产羔时间主要于每年的1月〜3月，这对于血液，特别是初乳的采集来说困难极大。2012年由内蒙古大学完成双峰驼全基因组序列图谱绘制和破译工作并在《Nature》系列科学杂志发表在线圭寸面文章，随后由GenBank将双峰驼全基因组数据（Ref Seq GCF-000767855.1）向全球公开释放。而原核表达系具有目的基因表达水平高，培养周期短[15]，操作简单，抗污染能力强，成本相对较低，遗传学、生理学特性明确等特点，所以用原核表达系统来制备抗体无疑是最佳的选择.
新生动物Fc受体其本质为跨膜蛋白，抗原表位主要集中于膜外部分，为了降低基因合成的成本，故截取膜外部分.另外，本实验室中未去掉信号肽的重组蛋白始终无法表达，而在同等条件下，去掉信号肽的重组蛋白却成功表达。根据“信号肽假说”，蛋白质分子中的信号肽是由15个30个氨基酸残基组成，能引导新合成肽链转移到内质网上的一段疏水性多肽.但在原核表达的过程中，信号肽序列中的密码子对大肠埃希氏菌来说可能是稀有密码子，而大肠埃希氏菌中没有或具有很少量能识别这些密码子的tRNA°国内早有报道，在相同条件下，切除信号肽后能提高重组蛋白的表达量.
对双峰驼FcRn重组蛋白表达条件的优化过程中发现，IPTG诱导浓度对目的蛋白表达量的影响不显著，而诱导时间的影响极为显著，这与文献[16]的研究结果相一致.
大丹直指
本研究通过基因合成、原核表达等方法获得与预期大小相符的双峰驼FcRn重组蛋白，确定其最佳IPTG诱导浓度为0.3mmol/L，最佳诱导时间为6h。间接ELISA检测其效价为1:32000,West ernblot鉴定该抗体能与重组蛋白发生特异性结合，上述结果证明已成功制备了高效价和特异性良好的兔抗双峰驼FcRn多克隆抗体，为进一步研究FcRn抗体在双峰驼黏膜表面的分布奠定了基础。
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Prokaryotic Expression of FCGRT Gene of Bactrian Camel
and Preparation of Its Polyclonal Antibodies
LIU Llping,HUO Xing-min,XIE Fei,ZHANG Wang-dong,WU Xiu-ping,LI Rui,LU Jia,WANG Wen-hui (College of Veterinary Medicine Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu,30070»Chia)
Abstract:In order to prepare the antibody against.Bactrian camel FcRn,the coding region was selected from FCGRT gene sequence of Bactrian camel included in NCBI.After the prediction and analysis of transmembrane structure and signal peptide,brane sequence without,signal peptide was intercepted and the recombinant,plasmid pET28a-FcRn was constructed.Then,the recombinant,plasmid was induced to express li EL21(DE3)by IPTG and its expression conditions were optimized.The polyclonal antibodies against.Bactrian camel was prepared by immun
izing rabbits with purified FcRn recombinant,protein,then its titer and specificity were detected by indirect.ELISA and Western blot.The results showed that,the recombinant,protein was the same as expected size(34ku)and expressed in the form of inclusion body.The optimal induction concentration of IPTG was0.3mmol/L and the induction time was6h.The titer of the antibody was1:32000by ELISA.Western blot,showed that,the antibody could specifically bind to the recombinant,protein.The results showed that,the FcRn polyclonal antibodiesy of rabbit.ant.i-Bact.rian camel had been successfully prepared with high titer and good specificity.
Key words:Bactrian camel FCGRT gene；FcRn recombinant,protein；prokaryotic expression；polyclonal antibody
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