及多克隆抗体制备
张 智1，2，刘 泽2，乌吉斯古楞1，2，刘重阳1，2，权璞宏1，2，任旭荣2，宋庆庆2，关平原1
（1. 内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床
诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；
2. 金宇保灵生物药品有限公司，兽用疫苗国家工程实验室，内蒙古呼和浩特 010020）
摘 要：为体外表达牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）PlpE基因及制备抗PlpE蛋白多克隆抗体，根据PlpE基因核酸序列设计了1对特异性引物，通过PCR扩增PlpE基因，构建重组质粒pET-32a-PlpE；摇菌提取质粒，进行双酶切鉴定，鉴定正确后将重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21（DE3）感受态细胞，加入IPTG 进行诱导，对诱导蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定；使用纯化蛋白PlpE免疫北京大耳白兔，制备多克隆抗体，并进行间接ELISA和Western Blot分析。结果显示，扩增的PlpE基因大小为1050 bp，在原核细胞中诱导表达的PlpE蛋白约56 kDa。间接ELISA结果显示，所制备多克隆 抗体效价可达1:512000；Western Blot 结果显示，所制备多克隆抗体反应性良好。PlpE蛋白的成功表达和多克隆抗体的成功制备，为下一步多杀性巴氏杆菌诊断方法的建立和疫苗研发奠定了基础。
关键词：多杀性巴氏杆菌；原核表达；PlpE基因；多克隆抗体
中图分类号：S855.1 文献标识码：B 文章编号：1005-944X（2021）01-0094-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.01.019 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Prokaryotic Expression of PlpE Protein of Bovine Pasteurella multocida
and Preparation of Polyclonal Antibodies
Zhang Zhi1，2，Liu Ze2，Wujisiguleng1，2，Liu Chongyang1，2，
Quan Puhong1，2，Ren Xurong2，Song Qingqing2，Guan Pingyuan1
（1. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Key Laboratory of Animal Disease Clinical Diagnosis Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Hohhot，Inner Mongolia 010018，China；
2. Jinyu Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，National Engineering Laboratory of Veterinary Vaccine，
Hohhot，Inner Mongolia 010020，China）
Abstract：In order to express the PlpE gene of bovine Pasteurella multocida in vitro and prepare corresponding polyclonal antibodies，a pair of specific primers were designed according to the nucleic acid sequence of the gene，then pET-32a-PlpE，the recombinant plasmid，was constructed through PCR amplification，after plasmid extraction and identification by double enzyme digestion，the recombinant plasmid was transformed into BL21（DE3）cells and the bacteria was induced by IPTG and the induced protein was identified by SDS-PAGE and Western Blot；Beijing White Rabbits were vaccinated with purified PlpE protein to prepare polyclonal antibodies，which were analyzed by indirect ELISA and Western Blot. The results showed that the a
mplified PlpE gene was 1050 bp，and the induced PlpE protein was about 56 kDa. It was shown that，by indirect ELISA，the titer of the polyclonal antibodies could be up to 1:512000；投稿日期：2020-10-26 修回日期：2020-11-06
通信作者：关平原。E-mail：**************
2021年第38卷第1期
多杀性巴氏杆菌病（Pasteurella multocida disease）是由巴氏杆菌属细菌感染所致的传染病，在同种或不同动物间可以相互传染[1]。在过去，按照感染动物的名称把该菌分别称为马、牛、羊、禽、兔巴氏杆菌，之后统一称为多杀性巴氏杆菌。动物的急性型表现以败血性和组织器官的出血性炎症为特征，又称为出血性败血症。慢性型经常表现为各脏器的化脓性病灶，且多与其他病原混合或继发感染[2]。该病在全球各国广泛分布，以热带和亚热带国家最为严重。
巴氏杆菌属包含3个亚种，即多杀亚种（Pasteurella multocida ssp. multocida）、败血亚种（Pasteurella multocida ssp. septica）及杀禽亚种（Pasteurella multocida ssp. gallicida）[3]。多杀性巴氏杆菌是巴氏杆菌科巴氏杆菌属重要成员，可引起多种动物疫病，如牛、兔出血性败血症，猪萎缩性鼻炎以及禽等。多杀性巴氏杆菌血清型复杂，根据特异性荚膜抗原（K）吸附与红细胞上间接血凝试验的结果不同，分为A、B、D、E、F 5个血清型。据报道[4]，近年来引发牛多杀性巴氏杆菌
病的巴氏杆菌血清型主要为A型和B型，且A型多杀性巴氏杆菌的流行呈逐渐上升趋势，严重影响我国及世界畜牧业发展。
再生魔脂蛋白E（PlpE）是多杀性巴氏杆菌的一种外膜脂蛋白，是最早发现于溶血性曼氏杆菌的一种脂蛋白，具有粘附宿主细胞的作用[5]。研究[6]表明，重组PlpE蛋白加入到疫苗制剂中，接种该疫苗的牛具有抵抗人工感染的能力。重组PlpE在牛中具有高度免疫原性，使牛获得性免疫力显著增强，由此证实PlpE是一种重要的保护性抗原。该蛋白分子量大小约39 kDa，可以在家禽和小鼠身上刺激产生良好的交叉保护性。
本试验拟通过扩增多杀性巴氏杆菌PlpE基因，构建pET-32a-PlpE原核表达载体，通过诱导表达且纯化PlpE蛋白，制备其多克隆抗体，以期为多杀性巴氏杆菌PlpE基因致病机制研究、诊断方法建立及疫苗研发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验试剂 牛多杀性巴氏杆菌核酸、牛多杀性巴氏杆菌阳性血清，均由金宇保灵生物药品有限公司提供；感受态细胞BL21（DE3）、感受态细胞JM109、pET-32a、pMD-19T、琼脂糖凝胶回收试
剂盒、蛋白Marker、T4连接酶、限制性内切酶（Bam HⅠ、Hin dⅢ）等，均购自大连宝生物（Takara）有限公司；HRP标记山羊抗牛IgG、HRP标记鼠抗兔IgG，购自Sigma公司；超敏型辣根过氧化氢酶DAB显试剂盒，购自上海生物生工有限公司；包涵体蛋白纯化试剂盒，购自康为世纪生物有限公司。可得性
1.1.2 试验动物 2月龄，体质量2~3 kg的北京大耳白兔，由金宇保灵生物药品有限公司提供。1.1.3 试验设备 生物安全柜、高速离心机、恒温培养箱、高速冷冻离心机、PCR仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、超声波细胞破碎仪、紫外照胶仪等，均由金宇保灵生物药品有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据GeneBank中登录的牛多杀性巴氏杆菌PlpE基因序列，使用Oligo 6软件设计1对特异性引物（上游引物F：5'-GG-ATCCTGTAGCGGTGGTGGCGGTAG-3'；下游引物R：5'-AAGCTTTTATTGTGCTTGGTGACTTTT-TTC-3'），预计扩增目的片段大小约1 050 bp。引物送上海生物生工有限公司合成。
1.2.2 PlpE基因扩增及表达载体构建 PCR扩增采用25 μL反应体系：Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板2 μL。反应程序为：首先94 ℃预变性5 min；94 ℃变性
学术会议在线and by Western Blot，the antibody could react well with the positive serum. It was concluded that a foundation was laid for the establishment of the method for identifying Pasteurella multocida and development of relevant vaccines in the future.
Key words：Pasteurella multocida；prokaryotic expression；PlpE gene；polyclonal antibody
60 s，62 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。将目的片段与pMD-19T连接，构建重组质粒pMD-19T-PlpE。使用Bam HⅠ和Hin dⅢ限制性内切酶对重组质粒pMD-19T-PlpE和pET-32a原核表达载体进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后分别进行胶回收；胶回收产物使用T4连接酶进行连接，然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，活化后涂布在含有氨苄抗性LB固体培养基上，倒置，37 ℃过夜培养。挑选单克隆菌落进行摇菌，提取质粒，使用Bam HⅠ和Hin dⅢ内切酶进行双酶切鉴定。
1.2.3 重组蛋白诱导表达 在培养好的LB固体培养基上挑取单克隆菌落接种至10 mL含有氨苄抗性的LB培养基，37 ℃，180 r/min过夜培养。取200 μL菌液接种于200 mL含有氨苄抗性的LB培养基，37 ℃，200 r/min培养5 h，在OD值达0.6~0.8时，加入IPTG，37 ℃，200 r/min，诱导培养4 h。然后将IPTG诱导表达后的菌液7 500 r/min，4 ℃离心20 min后弃上清。按照菌体沉淀: PBS=1:10（V:V）比
例加入PBS重悬沉淀，充分混匀后进行超声破碎（超声循环50%，超声3 s，停5 s，超声破碎40 min）。之后10 000 r/min，4 ℃离心20 min，分离上清和沉淀，向沉淀中加入10 mL PBS重悬。分别取上清和重悬后沉淀各60 μL加入20 μL 4×Loading Buffer，煮沸10 min，进行SDS-PAGE电泳检测以及考马斯亮蓝染分析。
周家鼎1.2.4 重组蛋白纯化 采用康为世纪生物有限公司包涵体蛋白纯化试剂盒纯化PlpE蛋白。纯化效果通过SDS-PAGE电泳检测以及马斯亮蓝染分析。
1.2.5 重组蛋白Western Blot鉴定 SDS-PAGE 电泳结束后，在120 V，80 min条件下进行电转移，转移结束后用5%脱脂乳4 ℃过夜封闭。使用PBST缓冲液洗涤膜4次，10 min/次；把牛多杀性巴氏杆菌阳性血清用PBST缓冲液按照1:200的比例稀释，将膜置于配好的稀释液中，室温反应2 h；使用PBST缓冲液洗涤4次，10 min/次；用PBST缓冲液按照1:5 000的比例稀释山羊抗牛的IgG抗体（HRP标记），将膜置于配好的稀释液中，室温反应2 h；使用PBST缓冲液洗涤4次，10 min/次；使用显液显并拍照。
1.2.6 多克隆抗体制备 选取状态较好的北京大耳白兔（2~3 kg/只）。免疫前观察1周，耳静脉采血，检测抗体作为阴性对照。首次免疫，取纯化抗原与等量弗氏完全佐剂按照1:1体积比充分混合，形成乳状液体，1 mL/只在腿部肌肉进行分点注射；14 d后加强免疫，取纯化抗原与弗氏不完全佐剂等量乳化混合，腿部肌肉分点注射，1 mL/只；
14 d后再次进行免疫，条件同上。三免后14 d心脏采血，分离血清测定抗体效价，所得血清即为多克隆抗体。
1.2.7 Western Blot检测PlpE蛋白多克隆血清反应性 目的蛋白SDS-PAGE电泳结束后，转印至PVDF膜上，用5%脱脂乳4 ℃过夜封闭。使用PBST缓冲液洗涤4次，10 min/次；把PlpE蛋白多抗血清用PBST缓冲液按照1:200的体积比稀释，把膜置于配好的稀释液中，室温反应2 h；使用PBST缓冲液洗涤4次，10 min/次；用PBST 缓冲液按照1:5 000的体积比稀释鼠抗兔的IgG抗体（HRP标记），将膜置于配好的稀释液中，室温反应2 h；使用PBST缓冲液洗涤4次，10 min/次；使用显液显并拍照。
1.2.8 PlpE蛋白多克隆抗体间接ELISA效价测定 采用上述纯化蛋白作为包被抗原，使用正交筛选法[7]确定最佳包被浓度，利用间接ELISA方法测定所制备多克隆抗体效价。
2 结果
中国青年运动的时代主题2.1 PlpE基因扩增和重组质粒双酶切鉴定
经1%琼脂糖凝胶电泳检测，牛多杀性巴氏杆菌PlpE基因PCR扩增大小为1 050 bp（图1），结果与预期大小一致。将pET-32a-PlpE重组质粒进行双酶切鉴定，与预期结果相符合（图2）。2.2 PlpE蛋白表达
将超声破碎后的样品离心后分离沉淀与上清，沉淀用适量PBS重悬。将上清与重悬沉淀上样进
2021年第38卷第1期
行SDS-PAGE 电泳检测以及考马斯亮蓝染分析。结果（图3~4）显示，PlpE 蛋白在56 kDa 处有明显条带，大小符合预期结果，且其主要表现为沉淀表达，上清中蛋白含量则较低。2.3 蛋白纯化
参考康为世纪生物有限公司包涵体纯化试剂盒使用说明书，纯化PlpE 蛋白。采用SDS-PAGE 电泳检测以及考马斯亮蓝染分析蛋白纯化效果。结果（图5）显示，PlpE 蛋白纯化后条带单一，表明纯化效果良好。2.4 Western Blot 检测
将纯化后的PlpE 蛋白进行SDS-PAGE 电泳、
M. Marker ；1~2. PlpE 基因。
图1 PCR 扩增PlpE 基因结果
M. Marker ；1. 重组质粒pET-32a-PlpE 。
图2
重组质粒双酶切鉴定结果
M. Marker ；1. 诱导前（BL21）；2~3. IPTG 诱导后（BL21）。
图3 IPTG 诱导前后PlpE
蛋白表达情况
M. Marker ；1. 超声破碎后原液；2. 超声后上清；3. 超声后沉淀。
图4 PlpE 蛋白在上清及沉淀中的表达情况
M. Marker ；1. 流穿液；2. 杂蛋白；3. 纯化蛋白原样。
图5 PlpE 蛋白纯化后SDS-PAGE 电泳检测
以及考马斯亮蓝染分析
转膜以及脱脂乳封闭，次日孵育牛多杀性巴氏杆菌阳性血清、阴性血清和HRP标记的山羊抗牛的IgG抗体，结果（图6~7）显示，孵育牛多杀性巴氏杆菌阳性血清有明显的特异性条带，而阴性血清则没有出现条带，证明该蛋白有很好的反应性，且大小符合预期结果。
2.5 PlpE蛋白多抗血清Western Blot检测
使用制备的兔多克隆血清对PlpE蛋白进行Western Blot检测，在适宜条件下进行转膜后，孵育PlpE蛋白多抗血清和阴性对照血清。结果（图8~9）显示，孵育PlpE蛋白多抗血清显后出现明显的特异性条带，而阴性对照血清则没有出现条带，说明制备的兔多抗血清与PlpE蛋白反应性良好，PlpE蛋白多克隆抗体成功制备。
2.6 PlpE蛋白多克隆抗体ELISA效价检测
使用间接ELISA法测定多克隆抗体效价，读取PlpE蛋白多克隆抗体在OD450 nm处的值（P）和阴性血清在OD450 nm处的值（N），且当P/N＞2.1时，所得多克隆抗体的最高稀释倍数为该多抗的效价[8]。结果（图10）显示，PlpE蛋白多克隆抗体效价高达1:512 000。
闽南语电影M. Marker；1. PlpE蛋白。
图6 牛多杀性巴氏杆菌阳性血清Western Blot检测结果
M. Marker；1. PlpE蛋白。
图7 牛多杀性巴氏杆菌阴性血清Western Blot检测结果
M. Marker；1. 纯化PlpE蛋白。
图8 PlpE蛋白多抗血清Western-Blot检测结果
M. Marker；1. 纯化PlpE蛋白。
图9 PlpE蛋白阴性血清Western Blot检测结果
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